Este kit Amplite® es de Fluorescencia roja y utiliza nuestro sustrato de peroxidasa Amplite® Red para cuantificar el peróxido de hidrógeno en soluciones y extractos celulares.
Descripción
El peróxido de hidrógeno (H2O2) es un subproducto metabólico del oxígeno reactivo que sirve como regulador clave para una serie de estados relacionados con el estrés oxidativo. Está involucrado en una serie de eventos biológicos que se han relacionado con el asma, la aterosclerosis, la vasculopatía diabética, la osteoporosis, una serie de enfermedades neurodegenerativas y el síndrome de Down. Ensayo de peróxido de hidrógeno fluorimétrico Amplite®
Quizás el aspecto más intrigante de la biología del H2O2 es el informe reciente de que los anticuerpos tienen la capacidad de convertir el oxígeno molecular en peróxido de hidrógeno para contribuir a los procesos normales de reconocimiento y destrucción del sistema inmunitario. La medición de esta especie reactiva ayudará a determinar cómo el estrés oxidativo modula diversas vías intracelulares.
El kit de ensayo de peróxido de hidrógeno Amplite® utiliza nuestro sustrato de peroxidasa Amplite® Red para cuantificar el peróxido de hidrógeno en soluciones y extractos celulares. También se puede usar para detectar una variedad de actividades de oxidasa a través de reacciones acopladas a enzimas.
El kit es un ensayo de “mezcla y lectura” optimizado que es compatible con los instrumentos de manipulación de líquidos HTS.
Nombre en Ingles: Amplite® Fluorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit *Red Fluorescence*
| Catalogo | Producto | Presentación |
|---|---|---|
| AAT-11501 | Ensayo de peróxido de hidrógeno fluorimétrico Amplite® Fluorescencia Roja* | 500 pruebas |
Importante: Solo para uso en investigación (RUO).
Plataforma
Lector de Microplacas de Flourescencia
| Excitación | 540 nm |
| Emisión | 590 nm |
| Cutoff | 570 nm |
| Placa recomendada | Negra sólida |
Componentes
| Componente A: Amplite™ Red Peroxidase Substrate | 1 vial |
| Componente B: H2O2 | 1 vial (3% solución estabilizadora, 200 µL) |
| Componente C: Buffer de ensayo | 1 botella (100 mL) |
| Componente D: Horseradish Peroxidase | 1 vial (20 unidades) |
| Componente E: DMSO | 1 vial (1 mL) |
Espectro
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Propiedades Espectrales
| Excitación (nm) | 571 |
| Emisión (nm) | 584 |
PREPARACION DE SOLUCIONES DE STOCK
A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
- Solución madre de sustrato de peroxidasa roja Amplite™ (100X):
Agregue 250 µL de DMSO (Componente E) en el vial de Amplite™ Red Substrate (Componente A). Esta solución madre debe usarse con prontitud. - Solución madre de peroxidasa (20 U/mL):
Agregue 1 ml de buffer de ensayo (componente C) al vial de peroxidasa de rábano picante (componente D). - Solución estándar de H2O2 (20 mM):
Agregue 22,7 µL de H2O2 al 3 % (0,88 M, componente B) en 977 µL de buffer de ensayo (componente C). Nota: la solución de H2O2 diluida no es estable. Las porciones no utilizadas deben desecharse.
PREPARACION DE SOLUCION ESTANDAR
Estándar de H2O2
Para su conveniencia puede usar el Planificador de dilución en serie: https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/11501
Agregue 1 μl de solución madre de H2O2 20 mM en 1999 μl de buffer de ensayo (componente C) para obtener un estándar de H2O2 10 μM (HS7). Tome el estándar de H2O2 10 µM y realice diluciones en serie 1:3 para obtener diluciones en serie del estándar de H2O2 (HS6 – HS1).
PREPARACION DE SOLUCION DE TRABAJO
Agregue 50 μL de solución madre de sustrato de peroxidasa roja Amplite™ (100X) y 200 μL de solución madre de peroxidasa (20 U/ml) en 4,75 ml de buffer de ensayo (componente C) para obtener un volumen total de 5 ml. Nota: Mantener alejado de la luz.
Para guia sobre la preparación de muestras de células, visite: https://www.aatbio.com/resources/guides/cell-sample-preparation.html
Imagenes
Figura 1. La respuesta a la dosis de peróxido de hidrógeno se midió en una placa negra sólida de 384 pocillos con el kit de ensayo de peróxido de hidrógeno Flourimetric Amplite® utilizando un lector de microplacas de fluorescencia Gemini (Molecular Devices).
Figura 2. Concentraciones de Concentraciones de H2O2 producido por DA solo y con varios péptidos de la secuencia C-terminal de α-syn 15 min (gris claro), 30 min (gris oscuro) y 60 min (negro) después de la incubación. La DA sola (sin péptido) produjo cantidades crecientes de H2O2 con el tiempo. La coincubación de DA con el péptido YEMPS mejoró la producción de H2O2, mientras que los péptidos que carecían de Y127- (EMPSEEGY) y S129- (NEAYEMP) produjeron menos H2O2 que la DA sola o con el péptido YEMPS. Además, la coincubación de DA con el péptido mutado en metionina (YEAPS) produjo las mayores cantidades de H2O2 entre todas las condiciones. *p<0,01 frente a ningún péptido, **p<0,01 frente a ningún péptido y YEMPS (ANOVA). *Fuente: Gráfico de la oxidación mediada por dopamina de metionina 127 en α-sinucleína causa citotoxicidad y oligomerización de α-sinucleína por Kazuhiro Nakaso, et al., PLOS ONE, febrero de 2013.
Figura 3. El tratamiento con GW9662 en células C22 induce la actividad de PPRE y la regulación positiva de PPARα. Las células C22 se trataron con antagonista de PPARγ (GW9662) durante 24 h con una concentración de 5 μM.
El ARN total se aisló de estos cultivos y se sometió a análisis qRT-PCR para PPARα (A). Para la normalización se utilizó la expresión del gen doméstico HPRT. Los valores ± SEM representan la inducción de veces relativa media de tres experimentos independientes. **P ≤0,01; ***P≤0,001. Se midió la actividad indicadora de luciferasa dual de PPRE en células C22 tratadas con control (Con) o GW9662 (B). La actividad de luciferasa se midió en lisados celulares y se normalizó a la actividad de renilla. (E.V-vector vacío). Los datos representan ± SD de tres experimentos independientes, valor P, prueba t de Student no apareada. Los sobrenadantes del cultivo se recolectaron y se sometieron a un ensayo de H2O2 según las instrucciones de fabricación (C). Fuente: La inducción de peroxisoma mediada por PPARα compensa la deficiencia de PPARγ en las células del club bronquiolar por Srikanth Karnati et al., PLOS, septiembre de 2018.
Bibliografía
Ver todas las 16 bibliografías: Citation Explorer
Neutrophil-Biomimetic “Nanobuffer” for Remodeling the Microenvironment in the Infarct Core and Protecting Neurons in the Penumbra via Neutralization of Detrimental Factors to Treat Ischemic Stroke
Authors: Liu, Shanshan and Xu, Jianpei and Liu, Yipu and You, Yang and Xie, Laozhi and Tong, Shiqiang and Chen, Yu and Liang, Kaifan and Zhou, Songlei and Li, Fengan and others,
Journal: ACS Applied Materials \& Interfaces (2022): 27743–27761
Macrophage-Disguised Manganese Dioxide Nanoparticles for Neuroprotection by Reducing Oxidative Stress and Modulating Inflammatory Microenvironment in Acute Ischemic Stroke
Authors: Li, Chao and Zhao, Zhenhao and Luo, Yifan and Ning, Tingting and Liu, Peixin and Chen, Qinjun and Chu, Yongchao and Guo, Qin and Zhang, Yiwen and Zhou, Wenxi and others,
Journal: Advanced Science (2021): 2101526
Redox-channeling polydopamine-ferrocene (PDA-Fc) coating to confer context-dependent and photothermal antimicrobial activities
Authors: Song, Jialin and Liu, Huan and Lei, Miao and Tan, Haoqi and Chen, Zhanyi and Antoshin, Artem and Payne, Gregory F and Qu, Xue and Liu, Changsheng
Journal: ACS applied materials \& interfaces (2020): 8915–8928
The polyamine putrescine promotes human epidermal melanogenesis
Authors: Sridharan, Aishwarya and Shi, Meng and Leo, Vonny Ivon and Subramaniam, Nagavidya and Lim, Thiam Chye and Uemura, Takeshi and Igarashi, Kazuei and Guan, Steven Thng Tien and Tan, Nguan Soon and Vardy, Leah A
Journal: Journal of Investigative Dermatology (2020)
Molecular hydrogen suppresses superoxide generation in the mitochondrial complex I and reduced mitochondrial membrane potential
Authors: Ishihara, Genki and Kawamoto, Kosuke and Komori, Nobuaki and Ishibashi, Toru
Journal: Biochemical and Biophysical Research Communications (2019)
Peroxisomes in endocrine pancreatic islets, possible protectors against lipotoxicity?
Authors: del Rocio Bonilla-Martinez, Hermelinda
Journal: (2018)
PPARα-mediated peroxisome induction compensates PPARγ-deficiency in bronchiolar club cells
Authors: Karnati, Srikanth and Oruqaj, Gani and Janga, Harshavardhan and Tumpara, Srinu and Colasante, Claudia and Van Veldhoven, Paul P and Braverman, Nancy and Pilatz, Adrian and Mariani, Thomas J and Baumgart-Vogt, Eveline
Journal: PloS one (2018): e0203466
Bio-inspired redox-cycling antimicrobial film for sustained generation of reactive oxygen species
Authors: Liu, Huan and Qu, Xue and Kim, Eunkyoung and Lei, Miao and Dai, Kai and Tan, Xiaoli and Xu, Miao and Li, Jinyang and Liu, Yangping and Shi, Xiaowen and others, undefined
Journal: Biomaterials (2018)
Functional Characterization of Peroxisomes in the Heart and the Role of Pex11 [alpha] and Pex14 in Cardiomyocytes
Authors: Chen, Jiangping
Journal: (2017)
Semaphorin 4D inhibits neutrophil activation and is involved in the pathogenesis of neutrophil-mediated autoimmune vasculitis
Authors: Nishide, Masayuki and Nojima, Satoshi and Ito, Daisuke and Takamatsu, Hyota and Koyama, Shohei and Kang, Sujin and Kimura, Tetsuya and Morimoto, Keiko and Hosokawa, Takashi and Hayama, Yoshitomo and others, undefined
Journal: Annals of the Rheumatic Diseases (2017): annrheumdis–2016
Referencias
Ver todas las 152 referencias: Citation Explorer
Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide
Authors: Belousov VV, Fradkov AF, Lukyanov KA, Staroverov DB, Shakhbazov KS, Terskikh AV, Lukyanov S.
Journal: Nat Methods (2006): 281
Effects of hydrogen peroxide (H(2)O(2)) on alkaline phosphatase activity and matrix mineralization of odontoblast and osteoblast cell lines
Authors: Lee DH, Lim BS, Lee YK, Yang HC.
Journal: Cell Biol Toxicol (2006): 39
Fluorescent quenching method for determination of trace hydrogen peroxide in rain water
Authors: Chen H, Yu H, Zhou Y, Wang L.
Journal: Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. (2006)
A parallel proteomic and metabolomic analysis of the hydrogen peroxide- and Sty1p-dependent stress response in Schizosaccharomyces pombe
Authors: Weeks ME, Sinclair J, Butt A, Chung YL, Worthington JL, Wilkinson CR, Griffiths J, Jones N, Waterfield MD, Timms JF.
Journal: Proteomics (2006): 2772
Comparative effects of alpha-tocopherol and gamma-tocotrienol against hydrogen peroxide induced apoptosis on primary-cultured astrocytes
Authors: Mazlan M, Sue Mian T, Mat Top G, Zurinah Wan Ngah W.
Journal: J Neurol Sci (2006): 5
Enzymatic oxidation of dipyridamole in homogeneous and micellar solutions in the horseradish peroxidase-hydrogen peroxide system
Authors: Almeida LE, Imasato H, Tabak M.
Journal: Biochim Biophys Acta (2006): 216
Specific aquaporins facilitate the diffusion of hydrogen peroxide across membranes
Authors: Bienert GP, Moller AL, Kristiansen KA, Schulz A, Moller IM, Schjoerring JK, Jahn TP.
Journal: J Biol Chem. (2006)
Simple and rapid determination of hydrogen peroxide using phosphine-based fluorescent reagents with sodium tungstate dihydrate
Authors: Onoda M, Uchiyama T, Mawatari K, Kaneko K, Nakagomi K.
Journal: Anal Sci (2006): 815
Cardioprotective role of endogenous hydrogen peroxide during ischemia-reperfusion injury in canine coronary microcirculation in vivo
Authors: Yada T, Shimokawa H, Hiramatsu O, Haruna Y, Morita Y, Kashihara N, Shinozaki Y, Mori H, Goto M, Ogasawara Y, Kajiya F.
Journal: Am J Physiol Heart Circ Physiol (2006): H1138
Effect of antisense oligonucleotide against Smac/DIABLO on inhibition of hydrogen peroxide induced myocardial apoptosis of neonatal rats
Authors: Liang PF, Huang XY, Long JH, Xiao MZ, Yang XH, Zhang PH.
Journal: Zhonghua Shao Shang Za Zhi (2006): 175
Application Notes
Dopamine-Mediated Oxidation of Methionine 127 in α-Synuclein
Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues
A Library of Well-Defined and Water-Soluble Poly(alkyl phosphonate)s with Adjustable Hydrolysis
Acetylcholinesterase Inhibitory Activity of Pigment Echinochrome A
Ameliorative Effect of Novel Vitamin Formula with Herbal Extracts on Scopolamine-Induced Alzheimer’s Disease
FAQ
Are coumarins water-soluble?
Are NADH and ROS related?
Can I measure NADPH without lysing my cells?
Can I use Amplite Fluorimetric Glutamic Acid Assay Kit with an absorbance microplate reader?
How are fatty acids activated?
AssayWise
Hydrogen Peroxide Detection
Selecting the right ROS probe
Acetylcholinesterase Quantification
Acetylcholinesterase Assays
Glycerol 3-Phosphate Assays