El kt de ensayo de relación NAD/NADH fluorimétrico de Fluorescencia roja proporciona un método conveniente para la detección sensible de NAD, NADH y su relación.
Descripción
Ensayo fluorimétrico de relación NAD/NADH Amplite® Fluorescencia Roja
El dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+) y el fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP+) son dos cofactores importantes que se encuentran en las células. NADH es la forma reducida, NAD+ es la forma oxidada de NADH. Su forma NADP con la adición de un grupo fosfato a la posición 2′ del nucleótido de adenilo a través de un enlace éster.
El NADP se utiliza en reacciones biológicas anabólicas, como la síntesis de ácidos grasos y ácidos nucleicos, que requieren NADPH como agente reductor. Los ensayos tradicionales de NAD/NADH y NADP/NADPH se realizan monitoreando la absorción de NADH o NADPH a 340 nm. Este método adolece de baja sensibilidad y alta interferencia, ya que el ensayo se realiza en el rango UV que requiere una microplaca de cuarzo costosa.
Nuestro kit de ensayo de relación NAD/NADH Amplite® proporciona un método conveniente para la detección sensible de NAD, NADH y su relación. Las enzimas del sistema reconocen específicamente NAD/NADH en una reacción de ciclo enzimático. No es necesario purificar NAD/NADH de la mezcla de muestra. La reacción del ciclo enzimático aumenta significativamente la sensibilidad de detección. Además, este ensayo tiene un ruido de fondo muy bajo ya que se ejecuta en el rango rojo visible que reduce significativamente la interferencia de las muestras biológicas. El ensayo ha demostrado alta sensibilidad y baja interferencia.
Este kit de ensayo de NAD/NADH fluorométrico Amplite® se puede realizar en un conveniente formato de placa de microtitulación de 96 pozoso de 384 pozos y se puede adaptar fácilmente a la automatización sin necesidad de pasos de separación.
Nombre en ingles: Amplite® Fluorimetric NAD/NADH Ratio Assay Kit *Red Fluorescence*
| Catalogo | Producto | Presentación |
|---|---|---|
| AAT-15263 | Ensayo fluorimétrico de relación NAD/NADH Amplite® *Fluorescencia Roja* | 250 pruebas |
Importante: Solo para uso en investigación (RUO).
Plataforma
Lector de microplacas de Fluorescencia
| Excitación | 540 nm |
| Emisión | 590 nm |
| Cutoff | 570 nm |
| Placa recomendada | Negra sólida |
Componentes
| Componente A: NAD/NADH Recycling Enzyme Mix | 2 botellas (polvo liofilizado) |
| Componente B: NADH Sensor Buffer | 1 botella (20 mL) |
| Componente C: NADH Standard | 1 vial (142 µg) |
| Componente D: NADH Extraction Solution | 1 botella (10 mL) |
| Componente E: NAD Extraction Solution | 1 botella (10 mL) |
| Componente F: NAD/NADH Control Solution | 1 botella (10 mL) |
| Componente G: NAD/NADH Lysis Buffer | 1 botella (10 mL) |
PREPARACION DE SOLUCION DE STOCK
A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
Solución estándar de NADH (1 mM)
Agregue 200 µl de tampón PBS en el vial de estándar de NADH (componente C) para obtener una solución madre de NADH de 1 mM (1 nmol/µl).
PREPARACION DE SOLUCION ESTANDAR
Para mayor comodidad, utilice el Planificador de dilución en serie: https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/15263
Estándar NADH
Utilice la solución estándar de NADH y el buffer PBS (pH 7,4) para generar una solución estándar de NADH de 30 µM (30 pmols/µL) (NS7). Luego tome la solución estándar de NADH de 30 µM para realizar diluciones en serie 1:3 para obtener los estándares de NADH diluidos en serie restantes (NS6-NS1). Nota: La solución estándar de NADH diluida es inestable y debe usarse dentro de las 4 horas.
PREPARACION DE SOLUCION DE TRABAJO
Agregue 10 ml de buffer del sensor de NADH (componente B) a la botella de mezcla de enzimas de reciclaje de NAD/NADH (componente A) y mezcle bien.
Nota: Esta solución de trabajo de NAD/NADH es suficiente para 125 ensayos en una placa de 96 pocillos. La solución de trabajo no es estable, utilícela inmediatamente y evite la exposición directa a la luz.
PREPARACION CELULAR
Para guia de la preparación de muestras de células, visite https://www.aatbio.com/resources/guides/cell-sample-preparation.html
Imagen
Figura 1. . La respuesta de NADH se midió con el kit de ensayo Fluorometrico NAD/NADH Ratio Amplite® en una placa negra sólida de 96 pozos utilizando un lector de microplacas Gemini (Molecular Devices).
Bibliografía
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Application Notes (en Ingles)
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Acetylcholinesterase Inhibitory Activity of Pigment Echinochrome A
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