Lisado de E.coli libre de células 

Cell-free E.coli lysate

Descripción

Nuestros lisados libres de células de E.coli son la maquinaria de purificación de proteínas aisladas de células bacterianas. Crean un sistema de expresión de proteínas libre de células ajustable y de alto rendimiento. Las ventajas de la expresión de proteínas libres de células son numerosas, entre otras cosas, permite a un científico:

• Para la estabilización directa y la integración cotraduccional de proteínas de membrana en nanodiscos.

• Expresión de proteínas que de otro modo serían tóxicas

CatalogoProductoPresentación
CU-21001Cell-free E.coli lysate-45 350 µl
CU-21011Cell-free E.coli lysate HighYield350 µl
CU-21033Cell-free E.coli lysate HighYield-T74 x 330 µl

Datasheet a petición, ya que son específicas del lote.

FEATURE
StatePolvo liofilizado
para disolver en agua
Peso Molecular10-11 kDa
BufferHEPES
pH after solving7.5
Divalent cationic tolerance6 mM
Acrylic Acid to Styrene Ratio45% a 55%
Almacenamiento (periodo largo)4°C
Estructura

Resultado de Laboratotio

En estrecha colaboración con el grupo de Volker Doetsch y Frank Bernhard, Instituto de Biofísica de la Universidad de Frankfurt, Alemania, proporcionamos un sistema abierto que se puede adaptar para una variedad de aplicaciones, con protocolos dedicados para proteínas de membrana, intercambio continuo (diálisis ) reacciones, y muchos más. Este sistema requiere más trabajo inicialmente que los kits listos para usar, pero proporciona la máxima flexibilidad en las variaciones de reacción.

Figura 1. Expresión libre de células estándar frente a HiYield de GFP. 1,7: marcador de PM, 2-6: expresión de lisado de alto rendimiento; variación de la concentración de Mg2+ (14, 16, 18, 20,22 mM). 8-12: Expresión de lisado estándar, misma variación de concentraciones de Mg2+. Se observó un óptimo de Mg2+ a ca. 16 mM para estas combinaciones de lisados libres de células y otros componentes de reacción. Los rendimientos oscilan entre 1,3 y 5 mg/ml para reacciones de alto rendimiento y entre 1 y 3,8 mg/ml para reacciones estándar. Datos proporcionados amablemente por Frank Bernhard, Universidad de Frankfurt, Departamento de Química Biofísica.

Equipo y Materiales requeridos adicinalmente

Required equipmentMicropipettor and Micropipetting tips
Thermomix / shaking incubator for 500 rpm and 30°C incubation
Ultrasonic device (Optional)
Dialysis chambers and feeding mix reservoirs, depending on reaction scales. Alternatively home-built dialysis chambers combined with dialysis membrane, cutoff 12-14 kDa.
Additional materials & chemicals1,4-Dithiotreitol (DTT)
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)
Acetic AcidAdenosine 5’-triphosphate (ATP)
Amino acids for cell-free expression
Complete protease inhibitor cocktailCytidine 5’-triphosphate di-sodium salt (CTP)
Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)
Folinic acid calcium salt
Guanosine 5’-triphosphate di-sodium salt (GTP)
2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethane sulfonic acid (HEPES)
Magnesium acetate tetrahydrate (Mg(oAc)2)
PEG 8,000
Phosphoenol pyruvic acid monopotassium salt (PEP)
Potassium acetate (KoAc)
Potassium chloride (KCl)
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4)
Potassium hydroxide (KOH)
Pyruvate kinase (PK)
RiboLock RNase inhibitor
Sodium azide (NaN3)
Sodium chloride
Tris base
tRNA E.coli MRE 600
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP)
Project specific materialsTemplate DNA
Optional: Positive control template DNA
Recommended: Suitable affinity chromatography matrix or magnetic beads SDS-PAGE/ Western Blot equipment and antibody
For membrane protein expressions: Pre-assembled MSP nanodisc
For membrane protein expressions: Detergents, e.g. Decylmaltoside, dodecylmaltoside

Bibligrafía

TITLEYEARAUTHOR
High-Level Cell-Free Production of Membrane Proteins with Nanodiscs2013Roos C., Kai L., Haberstock S., Proverbio D., Ghoshdastider U., Ma Y., Filipek S., Wang X., Dötsch V., Bernhard F.
Structural determinants of lipid specificity within Ups/PRELI lipid transfer proteins2019Miliara X., Tatsuta T., Berry J-L., Rouse S.L.,Solak K., Chorev D.S., Wu D., Robinson C.V., Matthews S.
Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding2019Rues R-B., Dong F., Dötsch V., & Bernhard F.
Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding2019MacVicar T., Ohba Y., Nolte H., Mayer F.-C., Tatsuta T., Sprenger H.-G., Lindner B., Zhao Y., Li J., Bruns C., Krüger M., Habich M., Rlemer J., Schwarzer R., Pasparakis M., Henscke S., Brüning J., Zamboni N., Langer T.
Chemical Blockage of the Mitochondrial Rhomboid Protease PARL by Novel Ketoamide Inhibitors Reveals Its Role in PINK1/Parkin-Dependent Mitophagy2022Poláchová E., Back K., Heuten E., Stanchev S., Tichá A., Lampe P., Majer P., Langer T., Lemberg M.K., Stříšovský K.
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