Kit de ensayo de fosfato fluorimétrico PhosphoWorks™ *Fluorescencia roja*. Este kit ha sido desarrollado para medir la actividad de cualquier enzima generadora de Pi utilizando nuestro sensor de fosfato fluorescente rojo.
Descripción
Las células utilizan una amplia variedad de ésteres de fosfato (Pi) y polifosfato como sustratos enzimáticos, segundos mensajeros, componentes estructurales de la membrana y reservas de energía vital. El fosfato está involucrado en muchos procesos biológicos. Por ejemplo, las fosfatasas, las ATPasas y varias otras enzimas catalizan reacciones bioquímicas en las que se libera fosfato inorgánico de un sustrato de fosfoéster. La detección de muchas enzimas metabolizadoras de fosfoésteres es difícil porque no se dispone de sustratos adecuados. Ensayo PhosphoWorks™ de Fosfato Fluorimétrico
Por lo general, ha sido necesario determinar la liberación de fosfato inorgánico mediante ensayos colorimétricos tediosos o métodos basados en radioisótopos. Este kit de ensayo de fosfato fluorimétrico PhosphoWorks™ ha sido desarrollado para medir la actividad de cualquier enzima generadora de Pi utilizando nuestro sensor de fosfato fluorescente rojo. El kit proporciona una detección sensible de Pi, una alternativa a los métodos radiactivos peligrosos y otros ensayos colorimétricos menos sensibles. La medición de Pi se basa en el cambio en la absorbancia y la fluorescencia de nuestro nuevo sensor de fosfato.
Nuestro kit proporciona todos los reactivos esenciales, incluido el sensor de fosfato, los estándares de fosfato y el buffer de ensayo. Se muestra que el ensayo cuantifica el fosfato en solución a concentraciones de al menos hasta 0,1 µM. Se puede utilizar para medir la cinética de la liberación de fosfato de las fosfatasas (como GTPasas y ATPasas) acoplando las dos reacciones enzimáticas.
El ensayo se puede realizar en un conveniente formato de placa de microtitulación de 96 pocillos o de 384 pocillos y se puede adaptar fácilmente a la automatización sin necesidad de pasos de separación.
Nombre en ingles: PhosphoWorks™ Fluorimetric Phosphate Assay Kit *Red Fluorescence*
| Catalogo | Producto | Presentación |
|---|---|---|
| AAT-21660 | PhosphoWorks™ Fluorimetric Phosphate Assay Kit *Red Fluorescence* | 125 pruebas |
| AAT-21661 | PhosphoWorks™ Fluorimetric Phosphate Assay Kit *Red Fluorescence* | 1250 pruebas |
Importante: Solo para uso en investigación (RUO).
Plataforma
Lector de Microplacas de Fluorescencia
| Excitación | 540 nm |
| Emisión | 590 nm |
| Cutoff | 570 nm |
| Placa recomendada | Negra sólida |
Componentes
| Componente A: Assay buffer | 10 botellas |
| Componente B: Phosphate Sensor | 10 viales (polvo liofilizado) |
| Componente C: 1 mM KH2PO4 | 1 vial (1 ml) |
PREPARACION DE SOLUCION DE STOCK
A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
Solución madre del sensor de fosfato (125X):
Agregue 20 µL de DMSO en el sensor de fosfato (componente B) para preparar una solución madre del sensor de fosfato 125X.
PREPARACION DE SOLUCION DE ESTANDAR
Para su conveniencia puede usar el Planificador de dilución en serie: https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/21660
Agregue 50 μl de KH2PO4 1 mM (componente C) en 950 μl de agua desionizada o buffer de reacción enzimático para obtener una solución estándar de fosfato 50 μM (PS7). Tome una solución estándar de fosfato 50 µM (PS7) y realice diluciones en serie 1:2 para obtener estándares de fosfato diluidos en serie (PS6 – PS1) con H2O desionizada o buffer de reacción enzimático.
PREPARACION DE SOLUCION DE TRABAJO
Agregue 20 μl de solución madre del sensor de fosfato 125X en 2,5 ml de H2O estéril y mezcle bien para obtener una solución de trabajo del sensor de fosfato. Evite la contaminación potencial de Pi. Nota: Evite la exposición directa del sensor de fosfato (componente B) a la luz. Debido a la alta sensibilidad de este ensayo a Pi, es extremadamente importante utilizar reactivos y material de laboratorio sin Pi.
Imagen
Figura 1. La respuesta a la dosis de fosfato se midió con el kit de ensayo de fosfato fluorimétrico PhosphoWorks™ en una placa negra sólida de 96 pocillos utilizando un lector de microplacas Novostar (BMG Labtech).
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