El ensayo de peroxidasa fluorimétrica (HRP) Amplite® de Fluorescencia infrarroja cercana se puede utilizar para ELISA, que caracteriza la cinética de la reacción enzimática y la detección de alto rendimiento de los inhibidores de la oxidasa, etc.
Descripción
Ensayo de peroxidasa fluorimétrica (HRP) Amplite® de Fluorescencia infrarroja cercana
La peroxidasa es una molécula pequeña (MW ~40 KD) que generalmente se puede conjugar con un anticuerpo en una proporción de 4:1. Debido a su pequeño tamaño, rara vez causa un problema de impedimento estérico con la formación del complejo anticuerpo/antígeno.
La peroxidasa es económica en comparación con otras enzimas marcadoras. La principal desventaja asociada con la peroxidasa es su baja tolerancia a muchos conservantes, como la azida de sodio, que inactiva la actividad de la peroxidasa incluso a bajas concentraciones. Los conjugados de HRP se utilizan ampliamente como reactivos de detección secundarios en ELISA, técnicas inmunohistoquímicas y análisis de transferencia Northern, Southern y Western.
Ofrecemos este ensayo HRP rápido (10 min) en un sistema de ensayo sin lavado, homogéneo y de un solo paso. Este kit utiliza Amplite® IR, nuestro sustrato HRP flurogénico infrarrojo cercano. Amplite® IR genera una sustancia que tiene una absorción máxima de 647 nm con una emisión máxima de 670 nm. Esta absorción y fluorescencia del infrarrojo cercano minimizan el fondo del ensayo que a menudo es causado por la autoabsorción y/o la autofluorescencia de muestras biológicas que rara vez absorben luz más allá de 600 nm.
El kit se puede utilizar para ELISA, que caracteriza la cinética de la reacción enzimática y la detección de alto rendimiento de los inhibidores de la oxidasa, etc. El kit proporciona un protocolo de ensayo optimizado de ‘mezclar y leer’ que es compatible con los instrumentos de manipulación de líquidos HTS.
Nombre en ingles: Amplite® Fluorimetric Peroxidase (HRP) Assay Kit *Near Infrared Fluorescence*
| Catalogo | Producto | Presentación |
|---|---|---|
| AAT-11553 | Ensayo de peroxidasa fluorimétrica (HRP) Amplite® de Fluorescencia infrarroja cercana | 500 pruebas |
Importante: Solo para uso en investigación (RUO).
Plataforma
Lector de Microplacas de Absorbancia
| Absorbancia | 647 ± 5 nm |
| Placa recomendada | Fondo claro |
Lector de Microplacas de Fluorescencia
| Excitación | 640 nm |
| Emisión | 680 nm |
| Cutoff | 665 nm |
| Placa recomendada | Negra sólida |
Componentes
| Componente A: Amplite™ IR Peroxidase Substrate | 1 vial |
| Componente B: H2O2 | 1 vial (3% sol estabilizadora, 200 µL) |
| Componente C: Buffer de ensayo | 1 bottella (100 ml) |
| Componente D: Horseradish Peroxidase | 1 vial (20 unidades) |
| Componente E: DMSO | 1 vial (0.5ml) |
PREPARACION DE SOLUCION DE STOCK
A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
1. Solución madre de sustrato de peroxidasa IR Amplite™ (100X) Agregue 250 µl de DMSO (componente E) en el vial de sustrato de peroxidasa IR Amplite™ (componente A) para preparar una solución madre de sustrato de peroxidasa IR Amplite™ 100X. La solución madre debe usarse con prontitud. Mantener alejado de la luz.
2. Solución estándar de HRP (20 U/mL) Agregue 1 ml de buffer de ensayo (componente C) al vial de peroxidasa de rábano picante (componente D) para obtener 20 U/ml de solución estándar de HRP.
3. Solución madre de H2O2 (20 mM) Agregue 22,7 µl de H2O2 al 3 % (0,88 M, componente B) en 977 µl de buffer de ensayo (componente C) para preparar una solución madre de H2O2 20 mM. Nota: La solución diluida de H2O2 no es estable. La porción no utilizada debe desecharse.
PREPARACION DE SOLUCION DE ESTANDAR
Para su conveniencia puede usar el Planificador de dilución en serie: https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/11553
Estándar HRP
Agregue 15 µL de solución estándar de HRP de 20 U/mL en 985 µL de buffer de ensayo (Componente C) para obtener una solución estándar de HRP de 300 mU/mL (SD7). Tome 300 mU/ml de solución estándar de HRP (SD7) y realice diluciones en serie 1:3 para obtener estándares de HRP diluidos en serie (SD6 – SD1) con buffer de ensayo (componente C).
PREPARACION DE SOLUCION DE TRABAJO
Agregue 50 μL de solución madre de sustrato de peroxidasa roja Amplite™ 100X y 50 μL de solución madre de H2O2 20 mM en 4,9 mL de buffer de ensayo (componente C) para preparar la solución de trabajo de HRP. Mantener alejado de la luz.
Espectro
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Propiedades Espectrales
| Excitación (nm) | 648 |
| Emisión (nm) | 668 |
Figura 1. La respuesta a la dosis de HRP se midió con el kit de ensayo de peroxidasa fluorimétrica Amplite® en una placa negra sólida de 384 pocillos utilizando un lector de microplacas de fluorescencia Gemini (Molecular Devices).
Producto Relacionado
| Name | Excitation (nm) | Emission (nm) |
| Amplite® Fluorimetric Peroxidase (HRP) Assay Kit *Red Fluorescence* | 571 | 584 |
Bibliografía
Identification of acetylcholinesterase inhibitors using homogenous cell-based assays in quantitative high-throughput screening platforms
Authors: Li, Shuaizhang and Huang, Ruili and Solomon, Samuel and Liu, Yitong and Zhao, Bin and Santillo, Michael F and Xia, Menghang
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Referencias
Ver todas las 49 referencias: Citation Explorer
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Application Notes
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FAQ
Are coumarins water-soluble?
Are NADH and ROS related?
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Can I use Amplite Fluorimetric Glutamic Acid Assay Kit with an absorbance microplate reader?
How are fatty acids activated?
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