Kit de cuantificación de colina Amplite® Este kit de cuantificación de colina Amplite® proporciona uno de los métodos más sensibles para cuantificar la colina.
Descripción
La colina y sus metabolitos juegan un papel importante en la integridad estructural y la señalización de las membranas celulares y la neurotransmisión colinérgica (síntesis de acetilcolina). Es una fuente importante de grupos metilo a través de su metabolito, la trimetilglicina, que participa en las vías de síntesis de S-adenosilmetionina. La deficiencia de colina puede causar enfermedad hepática, aterosclerosis y posiblemente trastornos neurológicos. A pesar de su importancia en el sistema nervioso central como precursor de la acetilcolina y la fosfatidilcolina de membrana, el papel de la colina en las enfermedades mentales ha sido poco estudiado.
Este kit de cuantificación de colina Amplite® proporciona uno de los métodos más sensibles para cuantificar la colina. El kit utiliza Amplite® Red para cuantificar la concentración de colina, que está relacionada con la producción de peróxido de hidrógeno en las reacciones de acoplamiento enzimático mediadas por colina oxidasa. La cantidad de colina es proporcional a la concentración de peróxido de hidrógeno formado en el ciclo de reacción de acoplamiento enzimático. En presencia de peroxidasa, la intensidad de fluorescencia de Amplite® Red es proporcional a la formación de peróxido de hidrógeno que se convierte en la concentración de colina.
El ensayo se puede leer fácilmente con un lector de microplacas de fluorescencia. Como alternativa, el ensayo también se puede leer a ~570 nm con un lector de microplacas de absorción.
| Catalogo | Producto | Presentación |
|---|---|---|
| AAT-40007 | Amplite® Choline Quantitation Kit | 200 ensayos |
Importante: Solo para uso en investigación (RUO).
Plataforma
Lector de Microplacas de Fluorescencia
| Excitación | 540 nm |
| Emisión | 590 nm |
| Cutoff | 570 nm |
| Placa recomendada | Negro sólido |
Componentes
| Component A: Amplite™ Red | 1 vial |
| Component B: Choline Probe | 2 bottles (polvo liofilizado) |
| Component C: Choline Standard | 1 vial (2.8 mg) |
| Component D: Buffer de ensayo | 1 botella (25 mL) |
| Component E: DMSO | 1 vial (100 µL) |
Espectro
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Propiedades espectrales
| Excitación (nm) | 571 |
| Emisión (nm) | 584 |
Preparación de Soluciones de Stock
A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
- Solución madre de Amplite™ Red (250X):
Agregue 40 µL de DMSO (Componente E) en el vial de sustrato Amplite™ Red (Componente A). La solución madre debe usarse con prontitud. Cualquier solución restante se debe dividir en alícuotas y volver a congelar a -20 oC. Nota: Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación. Nota: El sustrato Amplite™ Red es inestable en presencia de tioles como ditiotreitol (DTT) y 2-mercaptoetanol. La concentración final de DTT o 2-mercaptoetanol en la reacción no debe ser superior a 10 µM. El sustrato Amplite™ Red también es inestable a un pH alto (> 8,5). Por lo tanto, la reacción debe realizarse a pH 7-8. Se recomienda el tampón de ensayo proporcionado (pH 7,4). - Solución madre estándar de colina (50 mM):
Agregue 400 µL de ddH2O en el vial de Choline Standard (Componente C) y mezcle bien. Nota: La solución madre de colina no utilizada debe dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20oC.
Preparación de Soluciones de Trabajo
Agregue 5 ml de buffer de ensayo (componente D) al frasco de sonda de colina (componente B) y mézclelos bien. Agregue 20 µL de solución madre Amplite Red™ (250X) en la sonda de colina.
Preparacion de Solucion Estandar
Estándar de colina
Para mayor comodidad, utilice el Planificador de dilución en serie: https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/40007
Agregue 20 µL de solución estándar de colina (50 mM) a 980 µL de buffer de ensayo (componente D) para generar una solución estándar de 1000 µM. Nota: La solución estándar de colina diluida es inestable y debe usarse dentro de las primeras 4 horas. Lleve 30 µL de estándar de 1000 µM a 970 µL de buffer de ensayo (componente D) para generar una solución estándar de colina de 30 µM y luego realice diluciones en serie 1:3 para obtener colina de 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03 y 0 µM estándar. (Consulte el enlace en la Preparación de la solución estándar)
Figura 1. La respuesta a la dosis de colina se obtuvo con el kit de cuantificación de colina Amplite® en una placa negra sólida de 96 pozos utilizando un lector de microplacas de fluorescencia Gemini (Molecular Devices). Se pueden detectar niveles tan bajos como 100 nM (10 picomoles/pozo) de colina con un tiempo de incubación de 30 minutos (n=3).
Productos Relacionados
| Name | Excitation (nm) | Emission (nm) |
| Amplite® Ethanol Quantitation Kit | 571 | 584 |
| Amplite® Cholesterol Quantitation Kit | 571 | 584 |
Bibliografía
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