Kit de ensayo de peroxinitrito intracelular fluorimétrico Cell Meter™ de Fluorescencia verde. AAT Bioquest ha desarrollado DAX-J2™ PON Green, herramienta sensible para monitorear el nivel de peroxinitrito (ONOO-) en células vivas.
Descripción
El peroxinitrito (ONOO-) es una especie oxidante fuerte y un agente nitrante muy activo. El peroxinitrito se forma a partir de la reacción entre los radicales superóxido y el óxido nítrico generado en las células. Puede causar daños a una amplia gama de biomoléculas, incluidas proteínas, enzimas, lípidos y ácidos nucleicos, lo que eventualmente contribuye a la muerte celular. Mientras tanto, el peroxinitrito también puede tener actividades protectoras in vivo al contribuir a las respuestas de defensa del huésped contra los patógenos invasores.
Por lo tanto, el peroxinitrito es un oxidante biológico esencial involucrado en una amplia gama de procesos fisiológicos y patológicos. Debido a su vida media extremadamente corta y su baja concentración en estado estacionario, ha sido un desafío detectar y comprender el papel del peroxinitrito en los sistemas biológicos. El DAX-J2™ PON Green de AAT Bioquest se ha desarrollado para abordar esta necesidad insatisfecha. Proporciona una herramienta sensible para monitorear el nivel de ONOO en células vivas. DAX-J2™ PON Green de AAT Bioquest reacciona específicamente con ONOO- intercelular para generar un producto fluorescente de color verde brillante. Se puede utilizar en análisis de imágenes de fluorescencia, citometría de flujo y lectores de microplacas de fluorescencia.
Nombre en Ingles: Cell Meter™ Fluorimetric Intracellular Peroxynitrite Assay Kit *Green Fluorescence*
| Catalogo | Producto | Presentación |
|---|---|---|
| AAT-16315 | Kit de Ensayo de peroxinitrito intracelular fluorimétrico Cell Meter™ Fluorescencia Verd | 100 pruebas |
Importante: Solo para uso en investigación (RUO).
Plataforma
Microscopio de Fluorescencia
| Excitación | 490 nm |
| Emisión | 530 nm |
| Placa recomendada | Pared negra / fondo claro |
| Especificaciones instrumento | Juego de filtro FITC |
Lector de microplacas de Fluorescencia
| Excitación | 490 nm |
| Emisión | 530 nm |
| Cutoff | 515 nm |
| Placa recomendada | Pared negra / fondo claro |
| Especificaciones Instrumento | Modo de lectura inferior |
Componentes
| Componente A: DAX-J2™ PON Green | 1 vial |
| Componente B: Buffer de ensayo | 1 vial (1 mL/vial) |
| Componente C: DMSO | 1 vial (100 µL/vial) |
PREPARACION DE SOLUCION DE STOCK
A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
Solución madre DAX-J2™ PON Green (500X):
Agregue 20 µL de DMSO (Componente C) en el vial de DAX-J2™ PON Green (Componente A) y mezcle bien. Nota: 20 µL de solución madre de DAX-J2™ PON Green reconstituida es suficiente para 1 placa.
PREPARACION DE SOLUCION DE TRABAJO
Agregue 10 μL de solución madre del sensor de peroxinitrito DAX-J2™ reconstituido con DMSO 500X en 500 μL de buffer de ensayo (componente B) y mezcle bien. Nota: La solución de trabajo no es estable; prepárelo según sea necesario antes de usarlo.
Para guia sobre la preparación de muestras de células, visite:
https://www.aatbio.com/resources/guides/cell-sample-preparation.html
Imagenes
Figura 1. Imágenes de fluorescencia de peroxinitrito intracelular en células macrófagas RAW 264.7 utilizando el kit de ensayo de peroxinitrito intracelular fluorimétrico Cell Meter™ (n.° de cat. 16315). Se sembraron células 264.7 sin procesar a 100.000 células/pocillo/100 µl durante la noche en una placa de 96 pocillos de pared negra/fondo transparente Costar. Tratamiento SIN-1: las células se coincubaron con DAX-J2™ PON Green y SIN-1 100 µM a 37 °C durante 1 hora. Control sin tratar: las células RAW 264.7 se incubaron con DAX-J2™ PON Green sin tratamiento con SIN-1. Las señales de fluorescencia se midieron utilizando un microscopio de fluorescencia con un filtro FITC
Figura 2. Detección de peroxinitrito en células vivas tras el tratamiento con SIN-1 utilizando el kit de ensayo de peroxinitrito intracelular fluorimétrico Cell Meter™ (n.° de catálogo 16315). Se sembraron células RAW 264.7 a 100.000 células/pocillo/100 µl durante la noche en una placa de 96 pocillos Costar de pared negra/fondo transparente. Las células se coincubaron con la solución de trabajo DAX-J2™ PON Green y SIN-1 a una concentración de 50 a 200 µM a 37 ºC durante 1 hora. Las células incubadas con DAX-J2™ PON Green sin tratamiento con SIN-1 se usaron como control. La señal de fluorescencia se controló a Ex/Em = 490/530 nm (corte = 515 nm) con modo de lectura inferior utilizando un lector de microplacas FlexStation (Molecular Devices).
Figura 3. Medición del lector de microplacas de células RAW 264.7 marcadas con (A) DAX-J2 PON Green o (B) DHR 123. Las células RAW 264.7 se trataron con diferentes concentraciones de SIN-1. Se usó Ebselen a una concentración de 20 µM como eliminador de ONOO. En comparación con DHR 123, el ebselen inhibió más completamente el aumento de la fluorescencia de las células marcadas con DAX-J2 PON Green tras el tratamiento con SIN-1. Como en hallazgos anteriores, la oxidación de DHR 123 en cualquier tipo de célula puede involucrar no solo a ONOO- sino también a otras ROS/RNS relacionadas. Estos resultados resaltan aún más la alta selectividad de DAX-J2 PON Green para la detección de ONOO intracelular.
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Bibliografía
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