Como una proteina ayuda a purificar a otra proteina
¿Qué es la etiqueta GST?
Existen múltiples etiquetas de afinidad de proteínas que se utilizan para la purificación de proteínas y la etiqueta GST es una de ellas. GST es la abreviatura de glutatión-S-transferasa y se refiere a una proteína completa, no solo a unos pocos aminoácidos como la etiqueta Rho1D4. La etiqueta de la enzima GST se ha utilizado para la purificación de proteínas desde finales de la década de 1980 (Smith & Johnson 1988) y se ha establecido como una forma confiable para los ensayos de purificación de proteínas que requieren el más alto nivel de pureza (Harper & Speicher 2013).
El tamaño de la etiqueta GST es de 26 kDa y, por lo tanto, es realmente grande en comparación con otras etiquetas de afinidad de proteínas. En teoría, se puede fusionar con el extremo C o N de una proteína (Terpe 2003), pero recomendamos enfáticamente agregarlo al extremo N. Hasta ahora se ha utilizado con éxito para purificar proteínas de células bacterianas (Smith y Johnson 1988), levaduras (Lu et al. 1997) y células de mamíferos (Rudert et al. 1996). Sus características generales y secuencia se pueden encontrar aquí.
Ahora sabemos que la etiqueta GST básicamente es una proteína completa que se une a la proteína de interés. Pero ahora, ¿qué es exactamente la glutatión-S-transferasa?
¿Qué es GST / Glutatión-S-Transferasa?
Las glutatión-S-transferasas son una familia de enzimas procariotas y eucariotas que participan principalmente en la desintoxicación de las células y el cuerpo. En los casos más extremos, las proteínas GST pueden constituir hasta el 10 % del proteoma citosólico completo de algunas células de mamíferos (Oakley 2011). La reacción que catalizan las glutatión S-transferasas es la oxidación del glutatión reducido, también llamado GSH. La función principal de GST en la célula es la protección del ADN y las proteínas celulares de sustancias tóxicas externas. El mecanismo cataliza un ataque nucleofílico sobre la sustancia tóxica. Al activar un grupo tiol de GSH, reacciona con grupos adecuados sobre las sustancias tóxicas. Este acoplamiento de GSH a las toxinas conduce a su excreción de la célula oa una mayor procesión metabólica (Hayes et al. 2004). La alta especificidad de GST hacia el glutatión reducido (GSH) es la razón de la alta pureza de proteínas de los ensayos de purificación.
Como se indicó: existen numerosos ortólogos de GST, pero se eligió uno específico como plantilla para la etiqueta GST. Entonces, ¿por qué GST de Schistosoma japonicum?
¿Por qué GST de Schistosoma japonicum?
Las glutatión-S-transferasas se pueden encontrar en organismos que van desde procariotas hasta eucariotas (Allocati et al. 2008). Entonces, ¿por qué se usa esta proteína GST específica para la purificación por afinidad? ¿Cuáles son sus ventajas? Esta respuesta se remonta a la primera descripción de GST como una opción para la cromatografía de afinidad y la purificación de proteínas. Como se cita formalmente, la primera mención de GST para la purificación de proteínas fue en 1988 por Smith & Johnson. Antes de eso Smith et al. publicaron un artículo en el que describían el posible uso de GST como vacuna contra Schistosoma japonicum.
Schistosoma japonicum, un Platyhelminthes, es una de las principales causas de la enfermedad esquistosomiasis y la proteína GST de dicha especie prometía ser la base para una vacuna contra Schistosoma japonicum (Smith et al. 1988). Debido a este estudio, Smith ya trabajó con este ortólogo específico de la proteína GST y, por lo tanto, siguió siendo la base para el método de purificación de proteínas descrito más tarde. Y desde 1988, GST de Schistosoma japonicum permaneció como el ortólogo de GST que se usa como etiqueta de afinidad de GST.
Características de GST-Tag
Recopilamos los datos más importantes sobre la etiqueta GST y sus capacidades para la purificación de proteínas.
Nota: enumeramos la secuencia “estándar” utilizada en los vectores pGEX.
Tabla 1: Resumen de las características más importantes de la etiqueta GST
| FEATURES OF THE GST-TAG: | |
|---|---|
| Amino acid Sequence | MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEE HLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYID GDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERA EISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKV DFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTH PDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFK KRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATF GGGDHPPKSD |
| DNA sequence (Based on pGEX-4T1 vector) | ATG TCCCCTATAC TAGGTTATTG GAAAATTAAG GGCCTTGTGC AACCCACTCG ACTTCTTTTG GAATATCTTG AAGAAAAATA TGAAGAGCAT TTGTATGAGC GCGATGAAGG TGATAAATGG CGAAACAAAA AGTTTGAATT GGGTTTGGAG TTTCCCAATC TTCCTTATTA TATTGATGGT GATGTTAAAT TAACACAGTC TATGGCCATC ATACGTTATA TAGCTGACAA GCACAACATG TTGGGTGGTT GTCCAAAAGA GCGTGCAGAG ATTTCAATGC TTGAAGGAGC GGTTTTGGAT ATTAGATACG GTGTTTCGAG AATTGCATAT AGTAAAGACT TTGAAACTCT CAAAGTTGAT TTTCTTAGCA AGCTACCTGA AATGCTGAAA ATGTTCGAAG ATCGTTTATG TCATAAAACA TATTTAAATG GTGATCATGT AACCCATCCT GACTTCATGT TGTATGACGC TCTTGATGTT GTTTTATACA TGGACCCAAT GTGCCTGGAT GCGTTCCCAA AATTAGTTTG TTTTAAAAAA CGTATTGAAG CTATCCCACA AATTGATAAG TACTTGAAAT CCAGCAAGTA TATAGCATGG CCTTTGCAGG GCTGGCAAGC CACGTTTGGT GGTGGCGACC ATCCTCCAAA ATCGGATCTG GTTCCGCGTG GATCCCCGGA ATTCCCGGGT CGACTCGAGC GGCCGCATCG TGACTGA |
| Size | 26 kDa |
| Compatibility to recombinant proteins | N-terminus is highly recommended |
| Combinable with other affinity tags? | Yes, see our GST-and-Rho-tagged eGFP as an example |
| Specificity of interaction (KD) | 1 µM |
| Typical protein yield per ml of high-quality purification resin. | 10-12 mg/ml |
| Elution conditions | Reduced Glutathione, pH shift, or tag cleavage |
| Binds to purification resin / magnetic bead via | Reduced Glutathione |
| Suitable protein purification methods | Agarose resin & magnetic beads |
Cómo agregar/clonar una etiqueta GST en un plásmido
La mejor manera de agregar una etiqueta GST a una proteína de interés es usar un vector de la serie pGEX. También vienen con diferentes sitios de escisión de proteínas. Estos son importantes para los métodos mencionados más adelante para eliminar una etiqueta GST. La Figura 4 muestra el proceso y los pasos de nuestra estrategia de clonación recomendada.
1. Todos los vectores pGEX vienen con un sitio de clonación múltiple (MSC) que contiene múltiples sitios de digestión con enzimas de restricción. Estos varían de vector pGEX a vector. La Tabla 2 proporciona una descripción general aquí. Además, todos los vectores pGEX contienen tres codones de parada que cubren los tres marcos de lectura posibles en una cepa de ADN, después de la MSC. Esto es para asegurar que la proteína expresada no tenga que contener el codón de terminación por sí misma.
2. El siguiente paso es crear un producto de PCR de su gen/proteína de interés que esté flanqueado en ambas direcciones con sitios de restricción que están presentes en el MCS del vector pGEX elegido. Estos manuales deben cubrir cada uno:
1. Voladizo de 3-4 nts (cuanto más largo, mejor para la digestión de restricción, pero sugerimos 3-4)
2. El sitio de restricción
3. 20-25 nts de tu gen de interés
Permítanos darle un ejemplo de esto: intentemos asumir que desea agregar una etiqueta GST a eGFP.
Legend – Forward primer:
Overhang
Restriction site -> BamHI in this case
First 20 nts of eGFP
5′-GGG GGATCC ATGAAACATCACCATCACCA-3′
Legend – reverse Primer:
Overhang
Restriction site -> EcoRI in this case, reverse complement
The last 20 nts of eGFP, reverse complement
5′-GGG GGATTC TTTGTATAGTTCATCCATGC-3′
Importante: Tenga en cuenta que esta estrategia presentada es solo un ejemplo de cómo se puede agregar una etiqueta GST a una proteína de interés. Otros métodos como la recombinación homóloga en levaduras o bacterias también son formas posibles de lograr esto.
Tabla 2: Diferentes vectores pGEX y los sitios de restricción dentro de sus MCS, ordenados en dirección 5′ a 3′.
| PGEX VECTOR | RESTRICTION SITES IN 5′ TO 3′ DIRECTION |
|---|---|
| pGEX-1λT | BamHI , EcoRI |
| pGEX-2T | BamHI, SmaI, EcoRI |
| pGEX-2TK | BamHI, SmaI, EcoRI |
| pGEX-4T-1 | BamHI, EcoRI, SmaI, SalI, XhoI, NotI |
| pGEX-4T-2 | BamHI, EcoRI, SmaI, SalI, XhoI, NotI |
| pGEX-4T-3 | BamHI, EcoRI, SmaI, SalI, XhoI, NotI |
| pGEX-3X | BamHI, SmaI, EcoRI, |
| pGEX-5X-1 | BamHI, EcoRI, SmaI, SalI, XhoI, NotI |
| pGEX-5X-2 | BamHI, EcoRI, SmaI, SalI, XhoI, NotI |
| pGEX-5X-3 | BamHI, EcoRI, SmaI, SalI, XhoI, NotI |
| pGEX-6P-1 | BamHI, EcoRI, SmaI SalI, XhoI, NotI |
| pGEX-6P-2 | BamHI, EcoRI, SmaI SalI, XhoI, NotI |
| pGEX-6P-3 | BamHI, EcoRI, SmaI SalI, XhoI, NotI |
¿Cómo funciona la purificación de proteínas con etiqueta GST?
La purificación de proteínas con etiqueta GST es un método de cromatografía de afinidad. Aprovecha la alta afinidad de GST hacia el glutatión reducido, su sustrato natural. Para lograr esto, el glutatión se une a resina de agarosa o perlas magnéticas, según el método de purificación preferido. La figura 5 muestra una representación esquemática de tal cuenta.
El protocolo de purificación real difiere de un proveedor a otro de productos de afinidad con etiquetas GST. Estas diferencias también pueden incluir diferentes composiciones de tampones que solo están optimizadas para sus propias perlas de afinidad GST específicas. Por lo tanto, recomendamos encarecidamente no aplicar protocolos para la purificación de proteínas con etiqueta GST de un proveedor al producto de otro proveedor.
Usted puede encontrar los productos GST-tag affinity de Cube Biotech en este enlace.
Los protocolos correspondientes se enlistan aqui:
Agarose Resin GST-tag purification protocol:
Magnetic Bead GST-tag purification protocol:
Proteína GST-Tag
Protocolo de purificación
La purificación de proteínas con perlas de afinidad GST se presenta en la figura 5. Estos pasos principales se basan en el procedimiento de purificación que utiliza perlas magnéticas de afinidad con etiqueta GST.
Paso 1: El lisado celular después de la lisis celular. Todo el proteoma de la célula flota dentro del tampón de lisis. Las proteínas etiquetadas con GST no están separadas de las otras proteínas.
Paso 2: Adición de Affinity MagBeads con etiqueta GST al lisado celular. Deben agregarse más MagBeads de las que se sospecha de proteína etiquetada con GST dentro del lisado celular.
Paso 3: rotación del cubo/matraz durante un par de horas para dar a las perlas de glutatión tiempo suficiente para unir todas las proteínas etiquetadas con GST dentro del lisado celular.
Paso 4: las proteínas marcadas con GST ahora se han unido a MagBeads. Debido a la especificidad de la etiqueta GST con el glutatión en las perlas, ninguna otra proteína debería haberse unido.
Paso 5: Aplicación de una fuerza magnética sobre el lisado celular. Las proteínas etiquetadas con GST ahora se han unido a las perlas de glutatión, mientras que ninguna otra proteína lo ha hecho.
Paso 6: Eliminación de la proteína/lisado celular no unido. Las proteínas marcadas con GST ahora están purificadas.
Para verificar el éxito de una purificación con etiqueta GST, recomendamos realizar un Western Blot que utilice anticuerpos anti-GST para detectar la proteína purificada. Puede encontrar un protocolo de ejemplo de Western Blot aquí.
¿Cómo eliminar una etiqueta GST?
Con 26 kilodaltons (kDa), la etiqueta GST es una de las etiquetas de mayor afinidad que existen. Como de hecho es una proteína completa, puede incluso superar algunas proteínas a las que se une. Por supuesto, esto crea la preocupación válida de que una unión artificial de este tamaño a una proteína pueda interferir con la funcionalidad de dicha proteína. Por lo tanto, surge la pregunta de si es posible eliminar una etiqueta GST después de la purificación de la proteína para garantizar que no obstaculice la proteína purificada de ninguna manera.
Esta preocupación ya estaba en la mente de los creadores de la serie de vectores pGEX, que ya mencionamos en la tabla 2. Al crear una proteína de fusión de etiqueta GST de la manera descrita anteriormente en el capítulo “Cómo agregar/clonar una etiqueta GST en un plásmido”, tiene la opción de eliminar esta etiqueta GST más adelante.
La respuesta es agregar un sitio de escisión de proteína específico en la dirección 5′ del MCS del plásmido. De esta manera, la etiqueta GST N-terminal se puede escindir, incluso después de la purificación. Esto también se puede usar como un método de elución durante la purificación en lugar del tampón de elución que se menciona en nuestros protocolos de purificación con resina de agarosa y perlas magnéticas.
Dado que este método incluye una pequeña posibilidad de que su proteína de interés incluya un sitio de escisión de proteasa por coincidencia, hay tres opciones diferentes de sitios de escisión de proteínas que ya están presentes en los vectores pGEX.
Tabla 3: Diferentes vectores pGEX y su sitio de escisión de proteasa incluido.
Ejemplo de Protocolo – Eliminación de GST-Tag
Nota: Este protocolo describe cómo escindir una etiqueta GST utilizando el sitio de escisión de trombina de proteínas de fusión GST eluidas libres.
Tabla 4: Reactivos necesarios para la escisión de trombina
| REAGENT | AMOUNT |
|---|---|
| Thrombin | Depends on the supplier: 3-10 U of thrombin can cleave 1 mg of fusion protein at RT overnight on average. Still, read the supplier’s notes. |
| 1 X PBS buffer | 140mM NaCl; 2.7mM KCl; 10mM Na2HPO4; 1.8mM KH2PO4; pH 7.3 |
| PMSF | Enough for a 1 mM concentration in your protein solution |
| AEBSF | Alternative to PMFS; Enough for a 1mM concentration in your protein solution |
Procedimiento (version general)
– Añadir al eluato o columna de purificación 10 unidades de escisión de trombina ~10 µl por miligramo de proteína de fusión GST
– Mezcle suavemente e incube la mezcla a temperatura ambiente (22°C) durante 2 a 16 horas.
– Después de la digestión, puede detener la reacción agregando 1 mM de PMSF o ABESF
– Verifique los resultados a través de la página SDS ó
– Separe directamente los productos de escisión mediante cromatografía SDS (por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño)
Si ha encontrado sus condiciones de división satisfactorias, puede escalar el procedimiento de forma lineal.
Tip: Puede incubar una cantidad suficiente de su proteína etiquetada con GST para ver en geles SDS-Page con 0,01 a 0,06 unidades de trombina y diferentes tiempos de digestión (por ejemplo, 2 h, 4 h, 6 h, etc.). Detenga la reacción como se describe y almacene las alícuotas a -20°C hasta su uso.
Referencias
- Hayes, J. D., Flanagan, J. U. & Jowsey, I. R. GLUTATHIONE TRANSFERASES. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 45, 51–88 (2004).
- Allocati, N., Federici, L., Masulli, M. & Di Ilio, C. Glutathione transferases in bacteria. The FEBS Journal 276, 58–75 (2009).
- Oakley, A. Glutathione transferases: A structural perspective. Drug metabolism reviews 43, 138–51 (2011).
- Smith, D. B. et al. Mr 26,000 antigen of Schistosoma japonicum recognized by resistant WEHI 129/J mice is a parasite glutathione S-transferase. Proc Natl Acad Sci U S A 83, 8703–8707 (1986).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology 60, 523–533 (2003).
- Rudert, F. et al. pLEF, a novel vector for expression of glutathione S-transferase fusion proteins in mammalian cells. Gene 169, 281–282 (1996).
- Harper, S. & Speicher, D. W. Purification of proteins fused to glutathione S-transferase. Methods Mol Biol 681, 259–280 (2011).
- Smith, D. B. & Johnson, K. S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 67, 31–40 (1988).
- Lu, Q., Bauer, J. C. & Greener, A. Using Schizosaccharomyces pombe as a host for expression and purification of eukaryotic proteins. Gene 200, 135–144 (1997).
