Contenido:
- Flujo de trabajo de purificación de proteínas MagBead
- Guía completa de perlas magnéticas en YouTube
- Las ventajas de las perlas magnéticas / MagBeads en detalle
- ¿Cómo pueden las perlas magnetica purificar las proteinas?
- Propiedades de PureCube MagBead
- Química de superficies
- Productos de perlas magnetics
Flujo de trabajo de la purificación de proteínas MagBead paso a paso.
- Paso 1: El punto de partida habitual de la purificación de proteínas MagBead es un lisado celular en el que las proteínas de interés se mezclan con cualquier otra proteína que las células de expresión hayan producido simultáneamente.
- Paso 2: Retire el bufferde almacenamiento de las perlas magnéticas y lave dos veces con bufferde lavado. Agregue ahora una cantidad adecuada de perlas magnéticas al lisado. Le sugerimos que utilice puntas de pipeta estériles para esto.
- Paso 3: Agite la mezcla MagBead/Protein. Sugerimos una mezcla automatizada con una velocidad más lenta pero constante. ¡Sin vórtices! Una duración de unas 2 horas a temperatura ambiente es lo que consideramos suficiente. Es posible que la figura 1 solo muestre un tubo de microcentrífuga, pero también es adecuado un tubo falcon estéril.
- Paso4: Ahora, casi todas las proteínas de interés deberían haberse unido a un MagBead. Una vez más, es importante utilizar más perlas magnéticas que la proteína de interés presente para garantizar la máxima eficacia de unión.
- Paso 5: Aplique una fuerza magnética a sus perlas magnéticas para separarlas y, a su vez, la proteína de interés del resto del lisado. Para el tubo de microcentrífuga, sugerimos nuestro práctico separador MagBead.
- Paso 6: En el paso final, el resto del lisado celular que no se unió a las perlas magnéticas se eliminará usando nuevamente puntas peptídicas estériles. Mantenga activa la fuerza magnética para evitar la eliminación accidental de algunas cuentas magnéticas. Ahora lave las proteínas unidas al menos dos veces con bufferde lavado. Eluya sus proteínas con bufferde elución. Vórtice sus perlas lenta y constantemente con buffer de elución para eluir todas las proteínas unidas.
Opcional: Los pasos de lavado adicionales aumentarán la pureza de su proteína. Diferentes tipos de MagBeads pueden requerir diferentes tipos de buffers de lavado. Para ver cómo se prepara el buffer de lavado correspondiente para sus MagBeads, consulte nuestra página de protocolos y hojas de datos. También encontrará la información necesaria para eluir las proteínas de interés de las perlas magnéticas más adelante si es necesario para usted. No dude en ponerse en contacto con nosotros en caso de que tenga más preguntas.
Vea nuestra guía completa de perlas magnéticas por Roland Fabis, Ph.D.
El uso de perlas magnéticas para la purificación de proteínas tiene una serie de ventajas en comparación con las matrices de afinidad no magnéticas. Al mismo tiempo, hay muchos productos diferentes disponibles con diferentes características y beneficios. Este breve resumen lo ayudará a encontrar el producto óptimo para su investigación.
Fig. 2 (izquierda o arriba): Esquema de una perla magnética. Los núcleos magnéticos son todos muy consistentes. Fig. 3 (derecha o abajo): perlas magnéticas PureCube con un aumento de 100x.
¿Cómo pueden las perlas magnéticas purificar las proteínas?
La perla magnética en sí no puede interactuar con una proteína. Tiene que estar cargado de iones. Diferentes iones metálicos dan como resultado diferentes afinidades y especificidades por una proteína etiquetada con his. La herramienta más utilizada para purificar proteínas mediante cromatografía de afinidad es el ligando NTA-níquel (fig. 2). El ligando del ácido nitrilotriacético (NTA) se acopla a matrices como perlas magnéticas y luego se carga con iones. Los iones interactúan con proteínas etiquetadas específicas (p. ej., 6x proteínas etiquetadas con his). En la figura 4, los iones de níquel se cargan en una perla magnética. Aunque los iones de níquel son de color azul claro, las cuentas magnéticas parecen negras debido a los núcleos magnéticos.
Núcleo magnético
Las perlas magnéticas utilizadas en la purificación de proteínas contienen un núcleo magnético hecho de magnetita que está recubierto de diferentes materiales. Las perlas magnéticas suelen ser ferri (o ferro-) magnéticas o superparamagnéticas.
• Los núcleos ferri/ferromagnéticos suelen ser grandes (>30 nm) y muestran un fuerte momento magnético. Retienen este momento magnético incluso después de la eliminación del campo magnético. Este efecto se llama “remanencia magnética”. El fuerte campo magnético conduce a una rápida separación de las perlas en el campo magnético. Al mismo tiempo, a veces muestran automagnetismo y pueden adherirse a superficies metálicas. Las perlas magnéticas PureCube son ferrimagnéticas por defecto.
• Los núcleos magnéticos superparamagnéticos son más pequeños (5-30 nm) y su momento magnético es más débil. Cuando se elimina el campo magnético exterior, las cuentas pierden su magnetismo. La separación de las perlas en el campo magnético normalmente lleva más tiempo o es menos eficaz. Al mismo tiempo, se facilita el uso con superficies metálicas. En caso de que necesite perlas magnéticas superparamagnéticas, no dude en contactarnos.
Fig. 4: Para purificar proteínas, se acoplan diferentes ligandos con varios iones a la perla magnética. Esta figura muestra el ejemplo de un magbead de Ni-NTA.
Propiedades de las perlas PureCube MagBead
- Estándar: microesferas de tamaño mediano (20-40 µm) con un núcleo ferrimagnético y recubrimiento de agarosa: para alta unión a proteínas, baja unión inespecífica y separación eficiente
- XL: se encuentran disponibles perlas de agarosa magnéticas grandes o extragrandes (70-120 µm o hasta 400 µm) para aplicaciones especiales, y también se pueden modificar otros soportes magnéticos disponibles en el mercado con el ligando de afinidad de su elección. Póngase en contacto con nosotros para obtener más información.
Perlas magnéticas personalizadas
Si sus necesidades de perlas magnéticas exceden el repertorio común del mercado, puede contactarnos y describir qué características específicas necesitan sus perlas magnéticas para sus experimentos. Ya hemos cumplido una gran cantidad de pedidos personalizados con respecto a las cuentas magnéticas. Consulte esta descripción general para ver qué es posible.
Por ejemplo, las siguientes características pueden ser de su interés para personalizarlas:
Química de superficies
El núcleo magnético se puede recubrir en una gama de diferentes materiales, proporcionando diferentes propiedades.
- La agarosa forma una malla hidrófila tridimensional con carga neutra. Similar a la agarosa no magnética, es muy adecuada para unirse a proteínas, p. a través de ligandos de afinidad. La gran superficie de interacción conduce a altas capacidades de unión. La superficie neutra reduce la unión no específica.
- Las perlas de polivinilo tienen una superficie carboxilada que puede ser bastante rugosa (por la adición de cepillos de carboxilato) o bastante lisa. Ambas variantes a veces muestran unión inespecífica a proteínas. Su área de superficie disponible para la unión a proteínas es más pequeña que la de las perlas recubiertas de agarosa, por lo que suelen tener un tamaño más pequeño (1-2 µm) para proporcionar la misma capacidad de unión.
- Las perlas de sílice son las más utilizadas para la purificación de ácidos nucleicos. Se cargan negativamente al pH y, a menudo, muestran una unión inespecífica en la purificación de proteínas.
Tamaño
Las perlas magnéticas vienen en diferentes tamaños, lo que tiene un impacto en los resultados de manipulación y purificación.
- Perlas pequeñas (1-10 µm): proporcionan grandes áreas de superficie disponibles para la purificación de proteínas, pero un campo magnético más pequeño, que puede influir negativamente en la separación, especialmente de soluciones viscosas.
- Perlas medianas (20-40 µm): proporcionan una separación eficiente y una gran superficie. Cuando se combina con superficies de agarosa, la capacidad de unión puede estar en el mismo rango que para pequeñas perlas de polivinilo.
- Perlas grandes (70-120 µm): tienen ventajas para aplicaciones especiales, p. cuando los métodos de purificación contienen tanto separación magnética como filtración. Cuando se combina con superficies de agarosa, las capacidades de unión siguen siendo altas.
Productos de perlas magnéticas
Cube Biotech ofrece muchos productos diferentes de perlas magnéticas. Queremos darle una breve descripción: ¿Su producto no está en la lista? ¡No hay problema, podemos fabricarlo para usted!
