HisCube – Kit MIDI de purificación de proteínas Ni-INDIGO His-Tag

Midi kit

HisCube – Ni-INDIGO His-Tag Protein Purification MIDI Kit de Cube Biotech

Descripción

El kit MIDI de purificación de proteínas HisCube His-tag es nuestra forma de proporcionar a su laboratorio un método conveniente para purificaciones de proteínas His-tag de alta calidad a pequeña escala. Ponemos toda nuestra experiencia en purificaciones con etiquetas His en este kit para proporcionar un protocolo fácil de seguir.

El kit HisCube Ni-INDIGO MIDI contiene nuestra resina de agarosa PureCube 100 Ni-INDIGO desarrollada internamente y nuestros tubos giratorios por lotes PureCube 1-Step Batch MIDI.

La mayor ventaja de INDIGO es su tolerancia a los agentes reductores y quelantes. Estos pueden ser de gran ayuda en las purificaciones de etiquetas de His, pero las perlas de afinidad de etiquetas de His tradicionales no las toleran. EDTA es un quelante que se usa a menudo en tampones de células eucariotas porque tiene funciones inhibidoras de proteasas. DTT puede disolver agregados de proteínas que podrían dificultar potencialmente el acceso de las perlas de purificación a las proteínas marcadas con His. Pero gracias a INDIGO ahora se pueden utilizar ambas sustancias. Por lo tanto, están incluidos en el Kit.

CatalogoProductoPresentación
CU-80105HisCube – Ni-INDIGO His-Tag Protein Purification MIDI KitKit

Contenido del Kit

2 x 50 ml Binding Buffer
2 x 50 ml Wash Buffer
1 x 50 ml Elution Buffer
1 x 10 ml 100 Ni-INDIGO resin
5 x MIDI Spin Columns
50 x Collection Tubes
1 x 500 mM DTT (add 1,016 mL ddH2O)
1 x 500 mM EDTA (add 0.866 mL ddH2O)
Print-out of the protocol
Print-out of the fast protocol

Caracteristicas

NI-INDIGO RESIN
UsageSpecific binding and purification of 6x His tagged proteins
SpecificityAffinity to His-tagged proteins
Binding capacity>100 mg/mL
Bead LigandNi-INDIGO
Bead size100 μm
Filling quantityDelivered as a 50 % suspension
pH stability2-14
Chelator stability (e.g. EDTA)20mM
Reducing agent stability (e.g. DTT)20mM
Other stabilities100% methanol, 100% ethanol, 8 M urea, 6 M guanidinium hydrochloride, 30% (v/v) acetonitrile

Caracteristicas

PURECUBE MINI BATCH SPIN COLUMN
Body materialPolypropylene
Filter pore size0.1-0.2 µm low binding PVDF
Max. volume20 ml
Max. g force1,500-2,000 x g (swing-bucket rotor)
Min. g force100-200 x g for 1-10 min

Envio y Almacenamiento

Este producto se envia a temperatura ambiente. Almacenamiento a 2-8°C.

Resultado de laboratorio

Características clave de INDIGO

INDIGO se desarrolló para resolver dos problemas en lo que respecta a las purificaciones de proteínas con etiquetas His:
La tolerancia a ciertos ingredientes del tampón celular.
La pureza comparativamente baja de las purificaciones con etiqueta His en general
La idea principal era mantener el protocolo de purificación estándar que se usaba, p. Perlas de Ni-NTA sin cambios. Todo permanece sin cambios, excepto las perlas de agarosa/perlas magnéticas.

El ligando quelante que es principalmente responsable de las tolerancias frente a los productos químicos, la capacidad y la pureza. Por lo tanto, el objetivo era desarrollar e introducir un ligando que resistiera los reactivos de uso común como EDTA, DTT y fenantrolina para brindar al usuario un gran beneficio.

Figura 1: Rendimiento de proteína etiquetada con His en comparación con perlas basadas en INDIGO y productos de la competencia con EDTA 20 mM y DTT 10 mM.

Resistencia a EDTA y DTT del ligado INDIGO

La purificación de proteínas no se limita a organismos simples como E.coli. También se pueden usar células más complejas como células de mamíferos o líneas celulares de insectos para expresar y purificar proteínas. Estos sistemas vienen con composiciones tampón más complejas y algunos de sus ingredientes pueden interferir con los ligandos IMAC tradicionales. Éstas incluyen:
El EDTA se usa a menudo en tampones de células de mamíferos para inhibir cualquier proteasa que pueda disminuir el rendimiento de proteína. Pero también despoja a los ligandos NTA e IDA de sus iones de níquel, lo que inutiliza las perlas.
DTT, por otro lado, se puede usar para disolver agregados de proteínas en el lisado celular que podrían dificultar el acceso a la etiqueta His de la proteína. Al reducir el níquel, inutilizando así las perlas.
La fenantrolina como inhibidor de la proteasa es un quelante fuerte. Y por lo tanto se comporta de manera similar a EDTA.
Para abordar todos estos problemas, nuestro equipo de I+D desarrolló nuestro ligando INDIGO que aumenta la tolerancia a EDTA, DTT y fenantrolina de un procedimiento de purificación con etiqueta His hasta 20 mM cada uno.

Figura 2: fracciones de elución de un ensayo de purificación de etiqueta His utilizando resina de agarosa Ni-INDIGO con EDTA 20 mM en los buffers de purificación.

Pureza de proteína de INDIGO en comparación con Ni-NTA y reutilización

Como se mencionó anteriormente, los ensayos de purificación de proteínas con etiquetas de His pueden quedar rezagados en términos de pureza en comparación con otras etiquetas de afinidad. Buenos ejemplos de esto son las etiquetas de afinidad de anticuerpos como FLAG o Rho1D4.

Por otro lado, las purificaciones FLAG y Rho1D4 dan como resultado cantidades de proteína muy bajas (hasta 3-4 mg/ml de resina en el mejor de los casos) y son más adecuadas para proteínas con baja abundancia.

Figura 3: PureCube 100 Ni-INDIGO Agarose se puede reutilizar varias veces sin regeneración. Se añadió GFP a lisados de E.coli y se purificó en ocho alícuotas en la misma columna de 1 ml rellena con agarosa PureCube 100 Ni-INDIGO. Entre cada ejecución, la columna se lavó brevemente con buffer de carga que contenía PBS e imidazol 10 mM.

La purificación de proteína con etiqueta His logra los rendimientos de proteína más altos posibles. En nuestros controles de calidad internos para la resina Ni-INDIGO, normalmente obtenemos alrededor de 100 mg de proteína por ml de resina. La proteína utilizada para los controles de calidad es GFP marcada con His. Esta Video-Guía muestra la purificación His-Tag utilizando nuestras perlas His-Affinity. Además, las perlas INDIGO se pueden reutilizar varias veces, como se muestra en la figura 3. Además, se pueden regenerar siguiendo este protocolo.

Figura 4: PureCube Ni-NTA Agarose es resistente a la oxidación y regenerable. La agarosa PureCube Ni-NTA se expuso a DTT 5 mM durante 1 h (A). Después de demostrar que aún podía unirse a GFP (B), la resina se lavó, se decaparon (C) y se recargaron con Ni2+ (D) siguiendo el protocolo estándar de Cube (ver Protocolos y hojas de datos de Cube).

VIDEOS

Video Guide – Column Chromatography
Video Guide – Batch Spin Chromatography

FAQ

– ¿Cuáles son las razones de la unión no específica?

R: Algunas proteínas ricas en histidina también pueden unirse al níquel. Pero el lavado con NaOH después de la elución de la proteína de interés elimina las proteínas unidas inespecíficas de la resina.

– ¿Por qué debo agregar EDTA a mis buffers de purificación de etiquetas His?

R: EDTA es un quelante, lo que significa que se une a los cationes. Los cationes son cofactores comunes para las proteasas. La adición de EDTA, por lo tanto, asegura que las proteasas que todavía pueden estar presentes en sus soluciones, se vuelvan inactivas.

– ¿Por qué debo agregar DTT a mis buffers de purificación de etiquetas His?

R: DTT es un agente reductor. Su propósito es imitar la tendencia reductora natural del citosol. Con él, las proteínas pueden agregarse mediante la formación de nuevos puentes disulfuro no deseados. La DTT evita que esto suceda.

– ¿Se pueden pelar las perlas de Ni-INDIGO como las perlas NTA o IDA?

R: No. Esto no es posible.

¿Puedo reutilizar las perlas de Ni-INDIGO o puedo regenerarlas?

R: Sí se puede reutilizar las perlas. Recomendamos usar nuestro protocolo de lavado y regeneración INDIGO al menos después de cada 5 usos de las perlas.

Me quedé sin uno de los químicos / materiales del HisCube MINI Kit. ¿Puedo pedirlo por separado?

R: Si es posible. Aqui esta la lista de los materiales que usted puede solicitar por separado.

Descargo de responsabilidad:

Nuestros productos están destinados para investigación en aplicaciones de biología molecular. Estos productos no están destinados al diagnóstico, prevención o tratamiento de una enfermedad.

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