Kit de cuantificación de maleimida fluorimétrica *Fluorescencia verde*, Amplite®. Nuestro kit utiliza un tinte patentado que tiene una fluorescencia mejorada al reaccionar con una maleimida.
Descripción
Una variedad de reactivos que entrecruzan con un grupo maleimida se usan ampliamente para cruzar proteínas con proteínas o proteínas con otras biomoléculas. Hay pocos reactivos o kits de ensayo disponibles para cuantificar el número de grupos maleimida que se introducen en la primera proteína. Todos los kits comerciales tienen protocolos tediosos. Nuestro kit utiliza un tinte patentado que tiene una fluorescencia mejorada al reaccionar con una maleimida.
El kit proporciona un método fluorimétrico sensible de un solo paso con un limite de detección hasta de 10 picomoles de maleimida en un volumen de ensayo de 100 µL (en una concentración de 100 nM de maleimida). El ensayo es rápido y robusto. Se puede realizar en un conveniente formato de placa de microtitulación de 96 pozos o de 384 pozos y se puede adaptar fácilmente a la automatización. El kit proporciona un protocolo conveniente con todos los reactivos esenciales. Para la cuantificación rápida de una proteína del grupo maleimida, le recomendamos que utilice #5526. Para la cuantificación de un grupo maleimida de nanopartículas, le recomendamos que utilice #5525.
| Catalogo | Producto | Presentación |
|---|---|---|
| AAT-5523 | Amplite® Fluorimetric Maleimide Quantitation Kit *Green Fluorescence* | 200 pruebas |
Importante: Solo para uso en investigación (RUO).
Plataforma
Lector de Microplacas de Flourescencia
| Excitación | 490 nm |
| Emisión | 525 nm |
| Cutoff | 515 nm |
| Placa recomendada | Negra sólida |
Componentes
| Componente A: Maleimide Green™ | 1 vial |
| Componente B: Buffer de reacción | 1 vial (500 µL) |
| Componente C: Buffer de ensayo | 1 botella (25 mL) |
| Componente D: N-ethylmaleimide Standard | 1 vial (10 mM, 50 µL ) |
| Componente E: DMSO | 1 vial (200 µL) |
PREPARACION DE SOLUCIONES DE STOCK
A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
Solución madre de Maleimide GreenTM (500X)
Agregue 20 µL de DMSO (Componente E) en el vial de Maleimide GreenTM (Componente A) para preparar una solución madre de Maleimide GreenTM 500X. Nota: 10 µL de solución madre 500X Maleimide GreenTM es suficiente para una placa de 96 pocillos.
PREPARACION DE SOLUCIONES ESTANDAR
Para su conveniencia, utilice el Planificador de dilución en serie:
https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/5523
Estándar de N-etilaleimida
Agregue 10 μL de estándar de N-etilmaleimida 10 mM (10 nmol/μL) (componente D) a 990 μL de buffer de ensayo (componente C) para generar una solución estándar de N-etilmaleimida 100 μM (100 pmol/μL). Tome una solución estándar de N-etilaleimida 100 μM (100 pmol/μL) y diluya a 10 μM. A partir de una solución estándar de 10 μM (MS7), realice diluciones en serie 1:2 para obtener estándares de N-etilmaleimida diluidos en serie (MS6-MS1) con buffer de ensayo (componente C).
PREPARACION DE SOLUCIONES DE TRABAJO
Agregue 10 μL de solución madre 500X Maleimide GreenTM en 250 μL de buffer de reacción (componente B) y mezcle bien para hacer una mezcla de reacción 20X Maleimide. Incube la mezcla de reacción de Maleimida 20X a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos, protegida de la luz. Nota: Es muy importante incubar la mezcla de reacción de Maleimida 20X durante al menos 30 minutos para maximizar la relación señal/fondo. Nota: Debería ver el color amarillo después de agregar la solución madre 500X Maleimide GreenTM en el buffer de reacción (componente B).
Agregue toda la botella de mezcla de reacción de maleimida 20X en 5 ml de buffer de ensayo (componente C) y mezcle bien para obtener una solución de trabajo de maleimida. Nota: Esta solución de trabajo de Maleimida no es estable. Se debe usar dentro de la primera hora.
Imagen
Figura 1. La respuesta a la dosis de N-etilmaleimida se midió en una placa negra sólida de 96 pozos con el kit de ensayo de cuantificación de maleimida fluorimétrica Amplite™ usando un lector de microplacas NOVOstar (BMG Labtech).
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