Ensayo colorimétrico de relación NADP/NADPH Amplite®

Nuestro kit de ensayo de relación NADP/NADPH Amplite® proporciona un método conveniente para la detección sensible de NADP, NADPH y su relación.

Descripción

El dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+) y el fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP+) son dos cofactores importantes que se encuentran en las células. NADH es la forma reducida de NAD+, y NAD+ es la forma oxidada de NADH. Forma NADP con la adición de un grupo fosfato a la posición 2′ del nucleótido de adenilo a través de un enlace éster. El NADP se utiliza en reacciones biológicas anabólicas, como la síntesis de ácidos grasos y ácidos nucleicos, que requieren NADPH como agente reductor. Ensayo colorimétrico de relación NADP/NADPH Amplite®

Los ensayos tradicionales de NAD/NADH y NADP/NADPH se realizan monitoreando la absorción de NADH o NADPH a 340 nm. Este método adolece de baja sensibilidad y alta interferencia ya que el ensayo se realiza en el rango UV que requiere una microplaca de cuarzo costosa.

Nuestro kit de ensayo de relación NADP/NADPH Amplite® proporciona un método conveniente para la detección sensible de NADP, NADPH y su relación. La sonda NADPH es un sensor cromogénico que tiene su absorbancia máxima a ~460 nm tras la reducción de NADH. El aumento de absorbancia a ~460 nm es directamente proporcional a la concentración de NADPH en la solución. La sonda NADPH puede reconocer NADPH en una reacción libre de enzimas, y un lector de microplacas de absorbancia puede leer fácilmente la señal a ~460 nm. El kit de ensayo colorimétrico de NADPH Amplite® proporciona un ensayo sensible para detectar tan solo 3 µM de NADPH en un volumen de ensayo de 100 µL.

El ensayo se puede realizar en un conveniente formato de placa de microtitulación de 96 pocillos o de 384 pocillos.

Este kit se conoce en ingles como: Amplite® Colorimetric NADP/NADPH Ratio Assay Kit

Catalogo	Producto	Presentación
AAT-15274	Kit de ensayo colorimétrico de relación NADP/NADPH Amplite®	250 pruebas

SDS

Protocol

Importante: Solo para uso en investigación (RUO).

Plataforma

Lector de Microplacas de Absorbancia

Absorbancia	460 nm
Placa recomendada	Fondo claro

Componentes

Componente A: NADP/NADPH Recycling Enzyme Mix	2 botellas (polvo liofilizado)
Componente B-I: NADPH Probe	1 botella (4 ml)
Componente B-II: Buffer NADPH Probe	1 bottella (16 ml)
Componente C: Estandar NADPH	1 vial (167 µg)
Componente D: NADP solución extracción	1 botella (10 ml)
Componente E: Solución de neutralización	1 botella (10 ml)
Componente F: Solución de control de extracción	1 botella (10 ml)
Componente G: Buffer de lisis	1 botella (10 ml)

Preparacion de Células

Para obtener información sobre la preparación de muestras de células, visite https://www.aatbio.com/resources/guides/cell-sample-preparation.html

PREPARACION DE SOLUCION DE STOCK

A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.

Solución estándar de NADPH (1 mM) Agregue 200 µl de buffer PBS en el vial de estándar de NADPH (componente C) para obtener una solución madre de NADPH de 1 mM (1 nmol/µl).

PREPARACION DE SOLUCION DE ESTANDAR

Para su conveniencia puede usar el Planificador de dilución en serie: https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/15274

Estándar NADPH

Agregue 10 μl de solución madre de NADPH 1 mM en 490 μl de tampón PBS (pH 7,4) para generar una solución estándar de NADPH 20 μM (20 pmols/μl). A continuación, tome la solución estándar de NADPH de 20 µM y realice diluciones en serie 1:2 para obtener los estándares de NADPH diluidos en serie restantes (NS7 – NS1). Nota: la solución estándar de NADPH diluida es inestable y debe usarse dentro de las 4 horas.

PREPARACION DE SOLUCION DE TRABAJO

Agregue 8 ml de buffer de sonda NADPH (componente B-II) a la botella de mezcla de enzimas de reciclaje de NADP/NADPH (componente A) y mezcle bien. Agregue 2 ml de sonda NADPH (componente B-I) en la misma botella (del paso 1) y mezcle bien.

Nota: Esta solución de trabajo NADP/NADPH es suficiente para 125-200 ensayos. La solución de trabajo no es estable, utilícela inmediatamente y evite la exposición directa a la luz.

Figura 1. El kit de ensayo colorimétrico de relación NADP/NADPH Amplite® se utiliza para medir la cantidad total de NADP/NADPH en una microplaca blanca/transparente de 96 pocillos con un lector de microplacas SpectraMax (Molecular devices).

Figura 2. El kit de ensayo colorimétrico de relación NADP/NADPH Amplite® se utiliza para medir la cantidad total de NADP/NADPH y la relación NADP/NADPH en una microplaca blanca/transparente de 96 pocillos con un lector de microplacas SpectraMax (Molecular devices). Izquierda: respuesta a la dosis total de NADPH y NADP; Derecha: Relación NADP/NADPH: Se trató una cantidad igual de NADP y una mezcla de NADPH con o sin solución de extracción de NADP durante 15 minutos y luego se neutralizó con solución de extracción a temperatura ambiente. La señal se leyó a 460 nm. La relación molar NADP/NADPH se calcula en función de la absorbancia que se muestra en la figura de la derecha.

Bibliografía

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Systematic Engineering to Enhance 8-Hydroxygeraniol Production in Yeast
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The Linkage of Yeast Metabolites, Produced Under Hyperosmotic Stress, to Cellular Cofactor Systems During Icewine Fermentation.
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Tumor-Associated Neutrophils Dampen Adaptive Immunity and Promote Cutaneous Squamous Cell Carcinoma Development
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Glsnf1-mediated metabolic rearrangement participates in coping with heat stress and influencing secondary metabolism in Ganoderma lucidum
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Transcription factor YY1 promotes cell proliferation by directly activating the pentose phosphate pathway
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Enhanced 1, 3-propanediol production in Klebsiella pneumoniae by a combined strategy of strengthening the TCA cycle and weakening the glucose effect
Authors: Lu, Xinyao and Ren, Shunli and Lu, Jingzheng and Zong, Hong and Song, Jian and Zhuge, Bin
Journal: Journal of applied microbiology (2018)

Effects of salt stress on low molecular antioxidants and redox state of plastoquinone and P700 in Arabidopsis thaliana (glycophyte) and Eutrema salsugineum (halophyte)
Authors: Wiciarz, Monika and Niewiadomska, E and Kruk, Jerzy
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Enhancement of erythritol production by Trichosporonoides oedocephalis ATCC 16958 through regulating key enzyme activity and the NADPH/NADP ratio with metal ion supplementation
Authors: Li, Liangzhi and Kang, Pei and Ju, Xin and Chen, Jiajia and Zou, Huibin and Hu, Cuiying and Yan, Lishi
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Resveratrol attenuates excessive ethanol exposure induced insulin resistance in rats via improving NAD+/NADH ratio
Authors: Luo, Gang and Huang, Bingqing and Qiu, Xiang and Xiao, Lin and Wang, Ning and Gao, Qin and Yang, Wei and Hao, Liping
Journal: Molecular Nutrition & Food Research (2017)

Epigenetic regulation of Runx2 transcription and osteoblast differentiation by nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Ling, Min and Huang, Peixin and Islam, Shamima and Heruth, Daniel P and Li, Xuanan and Zhang, Li Qin and Li, Ding-You and Hu, Zhaohui and Ye, Shui Qing
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Referencias

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The Linkage of Yeast Metabolites, Produced Under Hyperosmotic Stress, to Cellular Cofactor Systems During Icewine Fermentation.
Authors: Allie, Robert
Journal: (2022)

Application Notes

A Library of Well-Defined and Water-Soluble Poly(alkyl phosphonate)s with Adjustable Hydrolysis
Acetylcholinesterase Inhibitory Activity of Pigment Echinochrome A
Ameliorative Effect of Novel Vitamin Formula with Herbal Extracts on Scopolamine-Induced Alzheimer’s Disease
An Increase in Plasma Homovanillic Acid with Cocoa Extract Consumption Is Associated with the Alleviation of Depressive Symptoms in Overweight or Obese Adults
Attenuation of lysyl oxidase and collagen gene expression in keratoconus patient corneal epithelium corresponds to disease severity

FAQ

Are NADH and ROS related?
What assay kits measure NADP/NADPH from cell samples?
Are coumarins water-soluble?
Can I measure NADPH without lysing my cells?
Can I use Amplite Fluorimetric Glutamic Acid Assay Kit with an absorbance microplate reader?

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