HisCube – Kit MIDI de purificación de proteínas Ni-INDIGO His-Tag

Características clave de INDIGO

INDIGO se desarrolló para resolver dos problemas en lo que respecta a las purificaciones de proteínas con etiquetas His:
La tolerancia a ciertos ingredientes del tampón celular.
La pureza comparativamente baja de las purificaciones con etiqueta His en general
La idea principal era mantener el protocolo de purificación estándar que se usaba, p. Perlas de Ni-NTA sin cambios. Todo permanece sin cambios, excepto las perlas de agarosa/perlas magnéticas.

El ligando quelante que es principalmente responsable de las tolerancias frente a los productos químicos, la capacidad y la pureza. Por lo tanto, el objetivo era desarrollar e introducir un ligando que resistiera los reactivos de uso común como EDTA, DTT y fenantrolina para brindar al usuario un gran beneficio.

Figura 1: Rendimiento de proteína etiquetada con His en comparación con perlas basadas en INDIGO y productos de la competencia con EDTA 20 mM y DTT 10 mM.

Resistencia a EDTA y DTT del ligado INDIGO

La purificación de proteínas no se limita a organismos simples como E.coli. También se pueden usar células más complejas como células de mamíferos o líneas celulares de insectos para expresar y purificar proteínas. Estos sistemas vienen con composiciones tampón más complejas y algunos de sus ingredientes pueden interferir con los ligandos IMAC tradicionales. Éstas incluyen:
El EDTA se usa a menudo en tampones de células de mamíferos para inhibir cualquier proteasa que pueda disminuir el rendimiento de proteína. Pero también despoja a los ligandos NTA e IDA de sus iones de níquel, lo que inutiliza las perlas.
DTT, por otro lado, se puede usar para disolver agregados de proteínas en el lisado celular que podrían dificultar el acceso a la etiqueta His de la proteína. Al reducir el níquel, inutilizando así las perlas.
La fenantrolina como inhibidor de la proteasa es un quelante fuerte. Y por lo tanto se comporta de manera similar a EDTA.
Para abordar todos estos problemas, nuestro equipo de I+D desarrolló nuestro ligando INDIGO que aumenta la tolerancia a EDTA, DTT y fenantrolina de un procedimiento de purificación con etiqueta His hasta 20 mM cada uno.

Figura 2: fracciones de elución de un ensayo de purificación de etiqueta His utilizando resina de agarosa Ni-INDIGO con EDTA 20 mM en los buffers de purificación.

Pureza de proteína de INDIGO en comparación con Ni-NTA y reutilización

Como se mencionó anteriormente, los ensayos de purificación de proteínas con etiquetas de His pueden quedar rezagados en términos de pureza en comparación con otras etiquetas de afinidad. Buenos ejemplos de esto son las etiquetas de afinidad de anticuerpos como FLAG o Rho1D4.

Por otro lado, las purificaciones FLAG y Rho1D4 dan como resultado cantidades de proteína muy bajas (hasta 3-4 mg/ml de resina en el mejor de los casos) y son más adecuadas para proteínas con baja abundancia.

Figura 3: PureCube 100 Ni-INDIGO Agarose se puede reutilizar varias veces sin regeneración. Se añadió GFP a lisados de E.coli y se purificó en ocho alícuotas en la misma columna de 1 ml rellena con agarosa PureCube 100 Ni-INDIGO. Entre cada ejecución, la columna se lavó brevemente con buffer de carga que contenía PBS e imidazol 10 mM.

Figura 4: PureCube Ni-NTA Agarose es resistente a la oxidación y regenerable. La agarosa PureCube Ni-NTA se expuso a DTT 5 mM durante 1 h (A). Después de demostrar que aún podía unirse a GFP (B), la resina se lavó, se decaparon (C) y se recargaron con Ni2+ (D) siguiendo el protocolo estándar de Cube (ver Protocolos y hojas de datos de Cube).