Calbryte™ 520, AM es un nuevo indicador fluorescente y permeable a las células para la medición del calcio intracelular
Descripción
Indicador Calbryte™ 520 AM
El ensayo de flujo de calcio intracelular es un método ampliamente utilizado para monitorear las vías de transducción de señales y la detección de alto rendimiento de receptores acoplados a proteína G (GPCR) y objetivos de canales de calcio. Seguido por Fluo-3 que se introdujo en 1989, Fluo-4, Fluo-8 y Cal-520 se desarrollaron más tarde con una relación señal/fondo mejorado y se convirtieron en los indicadores de Ca2+ ampliamente utilizados para microscopía confocal, citometría de flujo y aplicaciones de detección de alto rendimiento.
Sin embargo, todavía hay algunos problemas graves con Fluo-4. Por ejemplo, En cuanto a Fluo-3, en la mayoría de los ensayos de calcio intracelular con Fluo-4 AM, se requiere probenecid para evitar que el Fluo-4 cargado en las células se escape de las células. Compromete los resultados del ensayo ya que está bien documentado que el probenecid tiene una variedad de efectos celulares complicados.
Calbryte™ 520, AM es un nuevo indicador fluorescente y permeable a las células para la medición del calcio intracelular. Al igual que otros colorantes esteres AM, Calbryte™ 520 AM no es fluorescente ni activable.
Una vez que Calbryte™ 520 AM ingresa a la célula, es fácilmente hidrolizado por la esterasa intracelular donde se activa y responde al calcio. El indicador activado ahora es una molécula polar que es incapaz de difundirse libremente a través de la membrana celular, esencialmente atrapándolo dentro de la célula. Al unirse a los iones de calcio, Calbryte™ 520 produce una señal de fluorescencia brillante con una relación señal/fondo extremadamente alta. Tiene la misma longitud de onda de excitación y emisión que Fluo-4, por lo que la misma configuración de ensayo de Fluo-4 se puede aplicar fácilmente a los ensayos de calcio basados en Calbryte™ 520.
Su relación señal/fondo muy mejorada y sus propiedades de retención intracelular hacen de Calbryte™ 520 AM el indicador más robusto para evaluar los objetivos de los canales de calcio y GPCR, así como para detectar sus agonistas y antagonistas en células vivas.
| Catalogo | Producto | Presentación |
|---|---|---|
| 20650 | Indicador Calbryte™ 520 AM | 2 x 50 ug |
| 20651 | Indicador Calbryte™ 520 AM | 10 x 50 ug |
| 20653 | Indicador Calbryte™ 520 AM | 1 mg |
Importante: Solo para uso en investigación (RUO). Almacenamiento: Congelar a (< -15 °C), Minimizar la exposición a la luz.
Plataforma
Lector de Microplacas de Flourescencia
| Excitación | 490 nm |
| Emisión | 252 nm |
| Corte | 515 nm |
| Placa Recomendada | Paredes negras / fondo claro |
| Especificaciones Instrumento | Modo de lectura inferior / Manejo de líquidos programable |
Citómetro de flujo
| Laser de Excitación | 488 nm |
| Filtro de Emisión | 530/30 nm |
| Especificaciones instrumento | Canal FITC |
Microscopio de Flourescencia
| Excitación | FITC |
| Emisión | FITC |
| Placa recomendada | Paredes negras / fondo claro |
Propiedades Fisicas
| Dissociation constant (Kd, nM) | 1200 |
| Peso Molecular | 1090.90 |
| Solvente | DMSO |
Espectro
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Propiedades espectrales
| Excitación (nm) | 493 |
| Emisión (nm) | 515 |
| Rendimiento cuántico | 0.751 |
PREPARACION DE SOLUCIONES DE STOCK
A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
Solución madre Calbryte™ 520 AM
Prepare una solución madre de 2 a 5 mM de Calbryte™ 520 AM en DMSO anhidro.
PREPARACION DE SOLUCIONES DE TRABAJO
Solución de trabajo Calbryte™ 520 AM
El día del experimento, disuelva Calbryte™ 520 AM en DMSO o descongele una alícuota de la solución madre indicadora a temperatura ambiente. Prepare una solución de trabajo de tinte de 2 a 20 µM en un buffer de su elección (p. ej., Hanks y Hepes) con Pluronic® F-127 al 0,04 %. Para la mayoría de las líneas celulares, se recomienda Calbryte™ 520 AM a una concentración final de 4 a 5 μM. La concentración exacta de indicadores necesarios para la carga de células debe determinarse empíricamente.
Nota: El detergente no iónico Pluronic® F-127 a veces se usa para aumentar la solubilidad acuosa de Calbryte™ 520 AM. Se puede comprar una variedad de soluciones Pluronic® F-127 de AAT Bioquest.
Nota: Si sus células contienen transportadores de aniones orgánicos, se puede agregar probenecid (1-2 mM) a la solución de trabajo del colorante (la concentración final en el pocillo será de 0,5-1 mM) para reducir la fuga de los indicadores desesterificados. Se puede comprar una variedad de productos de probenecid ReadiUse™, que incluyen sal de sodio soluble en agua y solución estabilizada, en AAT Bioquest.
Calculadora
Preparación de la solución de stock común
Volumen de DMSO necesario para reconstituir la masa específica de Calbryte™ 520 AM a la concentración dada. Tenga en cuenta que el volumen es solo para preparar la solución madre. Consulte el protocolo experimental de muestra para conocer los buffers experimentales/fisiológicos apropiados.
| 0.1 mg | 0.5 mg | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 91.667 µL | 458.337 µL | 916.674 µL | 4.583 mL | 9.167 mL |
| 5 mM | 18.333 µL | 91.667 µL | 183.335 µL | 916.674 µL | 1.833 mL |
| 10 mM | 9.167 µL | 45.834 µL | 91.667 µL | 458.337 µL | 916.674 µL |
Imagenes
Figura 1. La respuesta de ATP se midió en células CHO-K1 usando Calbryte™ 520 AM (Cat No. 20653) y Fluo-4, AM (Cat No. 20550). Se sembraron células CHO-K1 50.000 células/100 µl/pozo durante la noche a en una placa costar de 96 pocillos de pared negra/fondo transparente. Se añadieron a los pozos 100 µl de 10 µg/ml de Calbryte™ 520 AM en buffer HH con probenecid o 10 µg/ml de Fluo-4, AM en buffer HH con probenecid y se incubaron durante 45 minutos a 37 °C.
Ambas soluciones de carga de tinte se eliminaron y se reemplazaron con 200 µl de buffer HH/pocillo. Se añadió ATP (50 µl/pocillo) para lograr la concentración final indicada de 10 µM. Las imágenes fueron adquiridas en un microscopio Keyence en el canal FITC.
Figura 2. La respuesta a la dosis de carbacol se midió en células CHO-M1 con Calbryte™ 520 AM y Fluo-4 AM. Se sembraron células CHO-M1 durante la noche a 50.000 células/100 µl/pocillo en una placa costar de 96 pocillos de pared negra/fondo transparente. Se añadieron 100 µl de 10 µg/ml de Calbryte™ 520 AM en buffer HH o 10 µg/ml de Fluo-4 en buffer HH y se incubaron durante 45 minutos a 37 °C. A continuación, la solución de carga de tinte se eliminó y se reemplazó con 200 µl de buffer HH/pocillo. FlexStation 3 añadió carbacol (50 µl/pocillo) para alcanzar las concentraciones finales indicadas.
Productos Relacionados
| Nombre | Excitation (nm) | Emission (nm) | Quantum yield |
| Calbryte™ 590 AM | 581 | 593 | – |
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| Calbryte™-520L AM | 493 | 515 | 0.751 |
| Calbryte™-520XL AM | 493 | 515 | 0.751 |
| Cal-520®, AM | 493 | 515 | 0.751 |
| Mag-520™ AM | 506 | 525 | – |
Bibliografía
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Referencias
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