Este kit está optimizado para los fluorómetros Cytocite™ y Qubit™ y puede detectar una amplia gama de endotoxinas (desde 1 UE/ml hasta 0,002 UE/ml) presentes en la muestra.
Descripción
El lipopolisacárido (LPS), también conocido como endotoxina, es el componente principal de las membranas externas de las bacterias Gram-negativas. El LPS es un potente estimulador del sistema inmunitario innato de los vertebrados y puede provocar fiebre, shock séptico y, finalmente, la muerte. También es reconocido como biomarcador para la detección de invasión de patógenos bacterianos y responsable del desarrollo de respuesta inflamatoria y shock endotóxico en casos extremos. La detección de LPS en materiales biológicos, como muestras de proteínas, péptidos o anticuerpos, es una tarea crítica para la biofabricación y el bioprocesamiento.
El kit de detección rápida de endotoxinas por fluorimetría Portelite™ utiliza Endotoxin Green™, un sustrato fluorogénico sensible. Endotoxin Green™ se puede hidrolizar en presencia de endotoxinas y el lisado de amebocitos de Limulus (LAL), un extracto de células sanguíneas de un cangrejo herradura, para generar una fuerte fluorescencia verde. La actividad de la endotoxina es proporcional a la intensidad de la fluorescencia resultante de la hidrólisis de Endotoxin Green™.
El kit está optimizado para los fluorómetros Cytocite™ y Qubit™ y puede detectar una amplia gama de endotoxinas (desde 1 UE/ml hasta 0,002 UE/ml) presentes en la muestra.
| Catalogo | Producto | Presentación |
|---|---|---|
| AAT-60008 | Portelite™ Rapid Fluorimetric Endotoxin Detection Kit | 50 pruebas |
| AAT-60009 | Portelite™ Rapid Fluorimetric Endotoxin Detection Kit | 500 pruebas |
Importante: Solo para uso en investigación (RUO).
Plataforma
Flurometro CytoCite
| Excitación | 480 nm |
| Emisión | 510-580 nm |
| Especificaciones Instrumento | 0.2 mL, tubo de PCR, pared delgada |
Componentes
| Componente A: Endotoxin Green™ | 1 vial |
| Componente B: Endotoxin-Free Water | 2 botellas (100 mL) |
| Componente C: Limulus Amebocyte Lysate | 2 viales |
| Componente D: E.coli Endotoxin Standard | 2 viales (100 EU/mL) |
| Componente E: DMSO | 1 vial (600 µL) |
PREPARACION DE SOLUCION DE STOCK
A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
- Solución madre de Endotoxin Green™
Para el kit 60008, agregue 50 µL de DMSO en un vial de Endotoxin Green™ (Componente A) para preparar una solución madre de sustrato de endotoxina. Para el kit 60009, agregue 500 µL de DMSO en un vial de Endotoxin Green™ (Componente A) para preparar una solución madre de sustrato de endotoxina.
Nota: Mantener alejado de la luz. - Solución madre de lisado de amebocitos de Limulus
Para el kit 60008, agregue 500 µl de agua libre de endotoxinas (componente B) al vial de lisado de amebocitos de Limulus (componente C) para preparar una solución madre de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) 5X. Para el kit 60009, agregue 2,5 ml de agua libre de endotoxinas (componente B) al vial de lisado de amebocitos de Limulus (componente C) para preparar una solución madre de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) 5X.
PREPARACION DE SOLUCION DE ESTANDAR
Para su conveniencia puede usar el Planificador de dilución en serie: https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/
Solución estándar de endotoxina de E.coli
Agregue 10 µL de solución estándar de endotoxina de E.coli de 100 UE/mL a 990 µL de agua libre de endotoxinas (componente B) para generar una solución estándar de endotoxina de E.coli de 1 UE/mL. Luego tome 1 EU/mL de solución estándar de endotoxina de E.coli y realice diluciones en serie 1:3 en agua libre de endotoxinas (componente B) para obtener estándares de endotoxina de E.coli diluidos en serie de 1 a 0,001 EU/mL.
PREPARACION DE SOLUCION DE TRABAJO
1. Solución de trabajo Endotoxin Green™
Para el kit 60008, agregue 50 µL de solución madre de Endotoxin Green™ en 5 mL de agua libre de endotoxinas (componente B) para obtener un volumen total de 5,05 mL de solución de trabajo de Endotoxin Green™. Para el kit 60009, agregue 500 µl de solución madre de Endotoxin Green™ en 50 ml de agua libre de endotoxinas (componente B) para obtener un volumen total de 50,5 ml de solución de trabajo de Endotoxin Green™.
Nota: Cada prueba necesita 100 µL, prepare la cantidad de solución de trabajo Endotoxin Green™ según sea necesario y antes de usar. Además, mantenga la solución de trabajo alejada de la luz después de la preparación, utilice un frasco o tubo sin endotoxinas y almacene las soluciones madre no utilizadas a -20 °C.
2. Solución de trabajo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL)
Para el kit 60008, agregue 500 µl de solución madre de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) en 2 ml de agua libre de endotoxinas (componente B) para obtener un volumen total de 2,5 ml de solución de trabajo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL). Para el kit 60009, agregue 2,5 ml de solución madre de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) en 10 ml de agua libre de endotoxinas (componente B) para obtener un volumen total de 12,5 ml de solución de trabajo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL).
Nota: Cada prueba necesita 50 uL, prepare la cantidad de solución de trabajo LAL según sea necesario y antes de usar. También mantenga la solución de trabajo alejada de la luz después de la preparación, use una botella o tubo sin endotoxinas y almacene las soluciones madre no utilizadas a -20 °C.
Imagen
Figura 1. La respuesta a la dosis de endotoxina de E.coli se midió en un tubo de PCR de pared delgada de 0,2 ml utilizando CytoCite™ con canal fluorescente verde. Se pueden detectar tan solo 0,002 UE/ml de endotoxina de E.coli con 10 minutos de incubación.
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Bibliografía
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Application Notes
Abbreviation of Common Chemical Compounds Related to Peptides
FITC (Fluorescein isothiocyanate)
Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Relative Brightness of Fluorescent Dyes
FAQ
Does RNA polymerase unzip DNA?
How to determine the brightness of a fluorescent molecule?
Is FITC a fluorophore?
What are common laser lines used in flow cytometry?
What are the different isomers of FITC?
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Portelite™ Fluorimetric Quantitation Kits: Companion Reagents Optimized for the CytoCite™ BG100 Spectrofluorometer
iFluor® 700 Dyes
A practical guide for use of PE and APC in flow cytometry
ReadiUse™ Lyophilized Phycobiliproteins
Therapeutic Monoclonal Antibody Fluorescent Labeling Tools for Imaging and Flow Cytometry