Introducción a las matrices de agarosa para la purificación de proteínas
¿Qué son las perlas de agarosa?
Las perlas de agarosa son hidrogeles con diferentes diámetros de partículas y concentraciones. La agarosa está hecha de unidades repetitivas de agarobiosa. Las perlas de agarosa normalmente están entrecruzadas y son porosas para que la proteína pueda fluir a través de las perlas. Las perlas son útiles para la cromatografía de exclusión por tamaño o de afinidad. Para la cromatografía de afinidad, los ligandos (como NTA o IDA) se unen covalentemente al polímero de perlas de agarosa para que las proteínas etiquetadas se puedan separar de otras proteínas.
Las matrices de agarosa se han utilizado para la purificación de proteínas durante décadas, y está disponible comercialmente una amplia variedad de matrices basadas en agarosa. Las propiedades físicas pueden variar significativamente entre las diferentes matrices. Este breve resumen lo ayudará a encontrar el producto óptimo para su investigación.
Superflow, Sepharose, Agarosa: ¿cuál es la diferencia?
En los últimos 20 años, se han realizado muchos desarrollos y se han creado nombres para diferentes tipos de matrices de agarosa:
PureCube Agarosa
Sepharose
Superflow
Nuestra agarosa PureCube es altamente reticulada y estable a la presión y, por lo tanto, comparable a las matrices de Sepharose y Superflow (consulte la Tabla 1). Para velocidades de flujo elevadas y una capacidad de unión a proteínas sin compromisos, recomendamos nuestra novedosa agarosa PureCube 100, que se ofrece para la purificación por afinidad His.
Sefarosa
Marca registrada de GE para agarosa reticulada en diferentes concentraciones y tamaños. Las propiedades de Sepharose varían según la concentración de agarosa y el grado de reticulación, y no todas las matrices de Sepharose son adecuadas para aplicaciones como FPLC.
Superflow
Ofrecido por varias empresas. El término describe una variante de agarosa altamente reticulada y estable a la presión, por lo que es adecuada para experimentos de FPLC. Este término se usa principalmente para distinguir entre agarosas estables a la presión y otras que muestran un menor grado de entrecruzamiento y se usan principalmente solo para purificaciones por lotes.
Comparación de tres matrices de agarosa disponibles comercialmente.
| CUBE BIOTECH | Proveedor G “SEPHAROSE” | proveedor Q “SUPERFLOW” | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Material | Highly cross-linked agarose | Highly cross-linked agarose | Highly cross-linked agarose | ||||||
| Agarose concentration |
| 6% / 4% | 6% | ||||||
| Pore size | medium | medium | medium | ||||||
| Mean particle size |
| 34 µm (HP) 90 µm (FF) | 60-160 µm | ||||||
| Recommended linear flow rate | >500 cm/h (PureCube) >1,000 cm/h (PureCube 100) | >150 cm/h | >150 cm/h | ||||||
| Max. flow rate | 6 ml/min | 4 or 20 ml/min (1 or 5 ml column) | 20 ml/min | ||||||
| Binding capacity: His-tagged proteins and Ni-NTA | up to 80 mg | 40 mg | up to 50 mg |
Tamaño del Poro
Cuanto mayor sea la concentración inicial de agarosa, menor será el tamaño de los poros que se forman después de la reticulación. Esto es particularmente importante si la agarosa se usa para la cromatografía de exclusión por tamaño.
Estabilidad de la presión
Cuanto mayor sea la concentración inicial de agarosa, mayor será el grado de reticulación y más resistentes a la presión se vuelven las perlas.
A. Agarosa de baja concentración
B. Aagarosa altamente concentrada con un bajo grado de entrecruzamiento
C. Agarosa altamente concentrada con un alto grado de reticulación
Líneas verdes: Polímero de agarosa | Puntos rojos: eventos de entrecruzamiento
¿Por qué las proteínas se unen a las perlas de agarosa?
Las perlas de agarosa no se unen naturalmente a las proteínas. Deben unirse a ligandos como NTA, glutatión o anticuerpos para permitir la purificación de proteínas a través de una interacción específica. Para la cromatografía de afinidad, las perlas de agarosa más utilizadas son las perlas de níquel-NTA.
Cromatografía de intercambio de iones
Filtración de geles | Cromatografía de exclusión por tamaño
Los grupos funcionales tales como aminas cuaternarias, DEAE, sulfopropilo o carboximetilo se pueden acoplar a la agarosa, dando lugar a intercambiadores de aniones fuertes o débiles, o intercambiadores de cationes fuertes o débiles, respectivamente. Para la cromatografía de intercambio iónico, las proteínas no requieren una etiqueta de afinidad, lo que hace que el método sea adecuado para la purificación de proteínas de fuentes naturales.
Las agarosas crosslinke se pueden utilizar para la cromatografía de exclusión por tamaño sin modificaciones adicionales. La resolución y el rango de tamaño dependen del tamaño de los poros. Como regla general, la correlación entre la concentración de agarosa y la capacidad de separación es la siguiente:
Tabla 2: Relación de la concentración de agarosa con los límites de exclusión de proteínas
| AGAROSE CONCENTRATION | PROTEIN EXCLUSION LIMIT (GLOBULAR PROTEINS) |
|---|---|
| 4% | ca. 30,000 kDa |
| 5% | ca. 10,000 kDa |
| 6% | ca. 4,000 kDa |
| 7,5% | ca. 1,200 kDa |
| 9% | ca. 150 kDa |
Fig. 5: PureCube Agarose muestra una mayor capacidad de unión dinámica que una matriz de la competencia con un tamaño de perla de 90 µm. BSA se purificó mediante dos matrices de intercambio iónico en un tampón Tris a pH 7,4 en una serie de experimentos realizados a caudales de 25 a 500 cm/h, correspondientes a 0,3-4,0 ml/min en una columna de 0,8×2,5 cm. Los rendimientos de proteína obtenidos con la matriz de la competencia disminuyeron significativamente cuando se aplicaron velocidades de flujo superiores a 100 cm/h (0,85 ml/min), mientras que la matriz de agarosa PureCube mostró rendimientos de proteína reproduciblemente altos incluso a velocidades de flujo altas como 500 cm/h (4 ml /min). Datos proporcionados amablemente por BioWorks, Suecia.
¿Por qué los diferentes tamaños de perlas?
Las preguntas más frecuentes en términos de resinas de agarosa y perlas de agarosa magnéticas son:
• “¿Para qué sirven estos diferentes tamaños?”
• “¿Qué tamaño de perla se adapta mejor a mis necesidades?”
Existen múltiples razones y propósitos para los diferentes tamaños de cuentas. Por lo general, como ocurre con muchas cosas en biología, todo se reduce a una compensación. La Figura 6 ofrece una descripción general de algunos tamaños de perlas que Cube Biotech tiene para ofrecer. Por supuesto, las perlas de agarosa también se pueden fabricar en tamaños que no se muestran aquí; sin embargo, estos tamaños son el “estándar” en las ciencias de la vida y, por lo tanto, sirven para la mayoría de las funciones.
Fig. 6: Resumen de diferentes tamaños de perlas de resina de agarosa ventajas de los diferentes tamaños. Las perlas más pequeñas tienen una mayor relación superficie-volumen y, por lo tanto, el mismo volumen de resina puede unir más proteínas que las perlas de mayor tamaño. Las perlas más grandes, por otro lado, permiten velocidades de flujo más altas, lo que las hace más útiles para medios celulares viscosos, purificación por lotes o flujo por gravedad.
Presión
Capacidad de vinculación
Capacidad de unión dinámica
Cuanto más pequeñas sean las perlas y más estrecha la distribución de tamaños, mayor será la resistencia a la presión de las perlas. Por el contrario, cuanto más grandes sean las perlas, más rápida será la velocidad de flujo en los experimentos por lotes y FPLC.
Cuanto más pequeñas sean las perlas, mayor será la relación entre superficie y volumen y mayor será la capacidad de unión de las perlas. Sin embargo, tenga en cuenta que la capacidad de unión también depende de otros factores, como el tipo y el tamaño del ligando y la densidad del acoplamiento del ligando.
La capacidad de unión del material de cromatografía de afinidad disminuye cuando se acumula presión dentro de la columna a velocidades de flujo más altas. Este efecto depende del tamaño de las perlas de agarosa, el contenido de agarosa y el grado de reticulación. La capacidad de unión dinámica nos dice si un material de agarosa se puede usar a velocidades de flujo más altas sin influir en los rendimientos de proteínas en una purificación. Consulte la Fig. 5 para ver una comparación de PureCube Agarose y un producto de la competencia.
Tamaños de perlas estándar de Cube Biotech
En Cube Biotech, podemos crear perlas de resina de agarosa de varios tamaños para satisfacer sus necesidades específicas. Sin embargo, también tenemos nuestros tamaños estándar que se pueden usar para la mayoría de nuestros productos.
Las perlas de resina de agarosa se ofrecen en tres tamaños estándar: 40 µm, 100 µm y 400 µm (XL).
MagBeads están disponibles en dos tamaños estándar: 30 µm y 90 µm (XL).
