Kit de ensayo fluorimétrico de NAD y NADH total Amplite® *Fluorescencia roja*. Proporciona un método conveniente para detección sensible de NAD y NADH.
Descripción
Ensayo fluorimétrico Amplite® de NAD y NADH total
El dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+) y el fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP+) son dos cofactores importantes que se encuentran en las células. NADH es la forma reducida de NAD+, y NAD+ es la forma oxidada de NADH. Forma NADP con la adición de un grupo fosfato a la posición 2′ del nucleótido de adenilo a través de un enlace éster. El NADP se utiliza en reacciones biológicas anabólicas, como la síntesis de ácidos grasos y ácidos nucleicos, que requieren NADPH como agente reductor.
En los cloroplastos, el NADP es un agente oxidante importante en las reacciones preliminares de la fotosíntesis. El NADPH producido por la fotosíntesis se usa luego como poder reductor para las reacciones biosintéticas en el ciclo de Calvin de la fotosíntesis. Los ensayos tradicionales de NAD/NADH y NADP/NADPH se realizan monitoreando la absorción de NADH o NADPH a 340 nm. Este método adolece de baja sensibilidad y alta interferencia ya que el ensayo se realiza en el rango UV que requiere una microplaca de cuarzo costosa.
Este kit de ensayo Amplite® NAD/NADH proporciona un método conveniente para la detección sensible de NAD y NADH. Las enzimas del sistema reconocen específicamente NAD/NADH en una reacción de ciclo enzimático. No es necesario purificar NAD/NADH de la mezcla de muestra. La reacción del ciclo enzimático aumenta significativamente la sensibilidad de detección. Además, este ensayo tiene un fondo muy bajo ya que se ejecuta en el rango rojo visible que reduce significativamente la interferencia de las muestras biológicas. El ensayo ha demostrado alta sensibilidad y baja interferencia con excitación de 570 nm y emisión de 590 nm.
Tambien conocido como: Amplite® Fluorimetric Total NAD and NADH Assay Kit *Red Fluorescence*
| Catalogo | Producto | Presentación |
|---|---|---|
| AAT-15257 | Kit de ensayo de NAD y NADH total fluorimétrico Amplite® Fluorescencia roja | 400 pruebas |
Importante: Solo para uso en investigación (RUO).
Plataforma
Lector de Microplacas de Fluorescencia
| Excitación | 540 nm |
| Emisión | 590 nm |
| Cutoff | 570 nm |
| Placa recomendada | Negra sólida |
Componentes
| Componente A: NAD/NADH Recycling Enzyme Mix | 2 botellas (polvo liofilizado) |
| Componente B: NADH Buffer de ensayo | 1 botella (20 mL) |
| Componente C: NADH Estandar | 1 vial (142 µg) |
PREPARACION DE SOLUCION DE STOCK
A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
Solución estándar de NADH (1 mM)
Agregue 200 µl de buffer PBS en el vial de estándar de NADH (componente C) para preparar una solución estándar de NADH de 1 mM (1 nmol/µl).
PREPARACION DE SOLUCION DE ESTANDAR
Para su conveniencia puede usar el Planificador de dilución en serie: https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/15257
Agregue 10 μl de solución estándar de NADH de 1 mM (1 nmol/μl) a 990 μl de buffer PBS 1X para generar una solución estándar de NADH de 10 μm (10 pmol/μl) (NS7). Tome una solución estándar de NADH de 10 µM (NS7) para realizar diluciones en serie 1:3 en buffer PBS 1X para obtener estándares de NADH diluidos en serie (NS6 – NS1). Nota: La solución estándar de NADH diluida es inestable y debe usarse dentro de las 4 horas.
PREPARACION DE SOLUCION DE TRABAJO
Agregue 10 ml de buffer del sensor de NADH (componente B) en la botella de mezcla de enzimas de reciclaje de NAD/NADH (componente A) y mezcle bien para obtener una solución de trabajo de NAD/NADH. Nota: Esta solución de trabajo de NAD/NADH es suficiente para dos placas de 96 pocillos.
Imagenes
Figura 1. La respuesta a la dosis de NADH se midió con Amplite® Total NAD and NADH Assay Kit en una placa negra sólida de 96 pocillos utilizando un lector de microplacas NOVOStar (BMG Labtech). RFU a Ex/Em = 540/590 nm.
Figura 2. Efectos de AA005 sobre la producción de ATP y la vía de señalización de AMPK/mTOR. (A) Estructura química de AA005-fluoresceína. (B) La localización intracelular de AA005. Las células se incubaron conjuntamente con AA005-flu a 100 nM durante 12 h y se analizaron mediante microscopía confocal utilizando un rastreador mitocondrial (rojo) para contrateñir las mitocondrias. (C) Ensayo MTT de células LOVO, HT29, HCT116 y HBEpiC sobre AA005-flu a las concentraciones indicadas durante 48 h. (D) AA005 disminuye el potencial transmembrana mitocondrial de las células de cáncer de colon revelado por el aumento de células negativas para rodamina 123. Las células se trataron con AA005 a la concentración indicada durante 24 h y se analizaron mediante tinción con rodamina 123 y citometría de flujo. (E) Las células se trataron con o sin AA005 a la concentración indicada durante 24 h, la relación NAD+/NADH se midió usando un kit de ensayo Colorimétrico NAD/NADH AmpliteTM. (F) Las células se trataron con o sin AA005 a la concentración indicada durante 24 h, y el contenido de ATP se midió utilizando un kit de ensayo de bioluminiscencia de ATP. (G) Las células se trataron con AA005 a la concentración y los puntos de tiempo indicados, se lisaron y se realizó un análisis de transferencia Western utilizando los anticuerpos indicados. Fuente: Gráfico de Identificación de un mimético de acetogenina anonácea, AA005, como activador de AMPK e inductor de autofagia en células de cáncer de colon por Yong-Qiang Liu et al., PLOS, octubre de 2012.
Productos Adicionales
Bibliografía
View all 66 citations: Citation Explorer
NAMPT-dependent NAD+ salvage is crucial for the decision between apoptotic and necrotic cell death under oxidative stress
Authors: Nishida, Takuto and Naguro, Isao and Ichijo, Hidenori
Journal: Cell Death Discovery (2022): 1–11
The Linkage of Yeast Metabolites, Produced Under Hyperosmotic Stress, to Cellular Cofactor Systems During Icewine Fermentation.
Authors: Allie, Robert
Journal: (2022)
B cell Sirt1 deacetylates histone and non-histone proteins for epigenetic modulation of AID expression and the antibody response
Authors: Gan, Huoqun and Shen, Tian and Chupp, Daniel P and Taylor, Julia R and Sanchez, Helia N and Li, Xin and Xu, Zhenming and Zan, Hong and Casali, Paolo
Journal: Science advances (2020): eaay2793
Enhanced 1, 3-propanediol production in Klebsiella pneumoniae by a combined strategy of strengthening the TCA cycle and weakening the glucose effect
Authors: Lu, Xinyao and Ren, Shunli and Lu, Jingzheng and Zong, Hong and Song, Jian and Zhuge, Bin
Journal: Journal of applied microbiology (2018)
Notoginsenoside R1 attenuates high glucose-induced endothelial damage in rat retinal capillary endothelial cells by modulating the intracellular redox state
Authors: Fan, Chunlan and Qiao, Yuan and Tang, Minke
Journal: Drug design, development and therapy (2017): 3343
Resveratrol attenuates excessive ethanol exposure induced insulin resistance in rats via improving NAD+/NADH ratio
Authors: Luo, Gang and Huang, Bingqing and Qiu, Xiang and Xiao, Lin and Wang, Ning and Gao, Qin and Yang, Wei and Hao, Liping
Journal: Molecular Nutrition & Food Research (2017)
Epigenetic regulation of Runx2 transcription and osteoblast differentiation by nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Ling, Min and Huang, Peixin and Islam, Shamima and Heruth, Daniel P and Li, Xuanan and Zhang, Li Qin and Li, Ding-You and Hu, Zhaohui and Ye, Shui Qing
Journal: Cell & Bioscience (2017): 27
MCU-dependent mitochondrial Ca2+ inhibits NAD+/SIRT3/SOD2 pathway to promote ROS production and metastasis of HCC cells
Authors: Ren, T and Zhang, H and Wang, J and Zhu, J and Jin, M and Wu, Y and Guo, X and Ji, L and Huang, Q and Yang, H and others, undefined
Journal: Oncogene (2017)
Mitochondrial elongation-mediated glucose metabolism reprogramming is essential for tumour cell survival during energy stress
Authors: Li, J and Huang, Q and Long, X and Guo, X and Sun, X and Jin, X and Li, Z and Ren, T and Yuan, P and Huang, X and others,
Journal: Oncogene (2017): 4901–4912
In vitro assay development and HTS of small-molecule human ABAD/17$\beta$-HSD10 inhibitors as therapeutics in Alzheimer’s disease
Authors: Aitken, Laura and Baillie, Gemma and Pannifer, Andrew and Morrison, Angus and Jones, Philip S and Smith, Terry K and McElroy, Stuart P and Gunn-Moore, Frank J
Journal: SLAS DISCOVERY: Advancing Life Sciences R\&D (2017): 676–685
Application Notes
Bio-inspired NADH regeneration by carbon nitride photocatalysis using diatom templates
Direct bioconversion of brown algae into ethanol by thermophilic bacterium Defluviitalea phaphyphila
GAPDH is critical for superior efficacy of female bone marrow-derived mesenchymal stem cells on pulmonary hypertension
Identification of an Annonaceous Acetogenin Mimetic, AA005, as an AMPK Activator and Autophagy Inducer in Colon Cancer Cells
Impaired SIRT1 nucleocytoplasmic shuttling in the senescent heart during ischemic stress
FAQ
What assay kits measure NAD/NADH from cell samples?
Are coumarins water-soluble?
Are NADH and ROS related?
Can I measure NADPH without lysing my cells?
Can I use Amplite Fluorimetric Glutamic Acid Assay Kit with an absorbance microplate reader?
AssayWise
Selecting the right ROS probe
Acetylcholinesterase Quantification
Acetylcholinesterase Assays
Glycerol 3-Phosphate Assays
Catalase Detection