Horseradish Peroxidase (HRP) es una enzima popular que se usa ampliamente en biología molecular para detectar complejos inmunes y objetivos biológicos como proteínas, carbohidratos y ácidos nucleicos. HRP generalmente se conjuga con anticuerpos, estreptavidina u otras proteínas y funciona como un sistema informador para aplicaciones de inmunoensayo basadas en sondas, que incluyen ICC, IHC, transferencia Western, hibridación in situ (ISH) y ELISAs.
AAT Bioquest ofrece una cartera completa de herramientas de etiquetado y conjugados de HRP, incluidos kits de etiquetado de anticuerpos HRP y poli-HRP, HRP conjugado con estreptavidina, anticuerpos secundarios y moléculas orgánicas pequeñas, así como kits de ensayo de cuantificación y actividad enzimática. También ofrecemos una amplia selección de sustratos HRP cromogénicos, fluorogénicos y quimioluminiscentes para satisfacer cualquier diseño experimental o configuración de instrumentos.
La adopción generalizada de HRP como sistema informador de enzimas se debe principalmente a tres factores. Primero, HRP tiene la capacidad de amplificar señales débiles y mejorar la detectabilidad de moléculas diana de baja abundancia. En segundo lugar, el tamaño relativamente pequeño de HRP (~44 kDa) en comparación con otras enzimas indicadoras como la fosfatasa alcalina (~140 kDa) mejora aún más la penetración intracelular en las muestras, reduce el impedimento estérico y minimiza la pérdida de inmunorreactividad. En tercer lugar, la alta tasa de rotación y la buena estabilidad de HRP permiten una generación de señales rápida y fuerte cuando se incuba con un sustrato adecuado.
El conjugado de poliHRP-estreptavidina MegaWox™ es un marcador enzimático que consta de un núcleo de heteropolímero HRP y una cubierta de estreptavidina. Del mismo modo, el conjugado de poliHRP-proteína A MegaWox™, el conjugado de IgG anti-conejo de cabra poliHRP y el conjugado de IgG anti-ratón de cabra poliHRP son etiquetas enzimáticas que consisten en un núcleo de heteropolímero HRP y proteína A, GAR o GAM como moléculas de unión objetivo. . Además, los kits de marcaje de anticuerpos Buccutite™ Poly-HRP permiten el marcaje directo de anticuerpos contra polímeros de HRP, lo que da como resultado conjugados que brindan la mayor sensibilidad y relación señal/ruido. Los conjugados de poli-HRP son ideales para aplicaciones donde el objetivo de interés es poco abundante o cuando el volumen de la muestra es limitado.
Cada molécula de un conjugado poli-HRP contiene una gran cantidad de HRP (peroxidasa de rábano picante polimerizada), lo que proporciona más actividad enzimática por evento de unión y, en consecuencia, una amplificación de la señal espectacular en las aplicaciones de ensayo convencionales. La amplificación se logra sin una modificación importante del procedimiento, y el conjugado puede emplearse en una variedad de ensayos, incluidos ELISA, IHC, ICC, Western Blot o hibridación in situ de ADN/ARN.
El conjugado de poli-HRP-estreptavidina se puede utilizar con prácticamente cualquier producto marcado con biotina, incluidas las sondas biotiniladas y los anticuerpos primarios y secundarios. El conjugado es especialmente aplicable a aplicaciones ELISA ultrasensibles, en las que se requiere una sensibilidad de picogramos a subpicogramos por ml. Como alternativa, la mejora de la señal por el conjugado puede aprovecharse para reducir el número y la duración de los pasos de procesamiento necesarios cuando se realizan ensayos convencionales de varios pasos, como ELISA, sin sacrificar la sensibilidad general del ensayo. Del mismo modo, la incorporación de un método de conjugado de poli-HRP de un solo paso puede acortar el procedimiento de IHC al evitar el anticuerpo secundario biotinilado de dos pasos y el paso de reactivo complejo de avidina-biotina (ABC) que se requiere al usar sistemas estándar de avidina-biotina.
Tabla 1. Productos de conjugados MegaWox™ poly-HRP
Los conjugados de HRP y poli-HRP se visualizan usando un sustrato que, cuando se oxida con HRP usando peróxido de hidrógeno, produce una señal cuantificable. Se han desarrollado y comercializado varios sustratos de HRP para explotar las características deseables de este sistema de detección de enzimas. Estos sustratos se dividen en tres categorías generales: sustratos cromogénicos, fluorogénicos o quimioluminiscentes.
Los sustratos colorimétricos producen un cambio de color visible que se puede medir con un lector de microplacas de absorbancia. Si bien son los más fáciles de usar y los más asequibles para la detección de HRP, los sustratos cromogénicos son menos sensibles que los sustratos fluorimétricos o quimioluminiscentes. Son ideales para aplicaciones donde la abundancia de objetivos es alta.
Los sustratos fluorimétricos producen subproductos altamente fluorescentes que se pueden medir con cualquier instrumento de fluorescencia. Ofrece mayor sensibilidad que los sustratos colorimétricos.
Los sustratos quimioluminiscentes generan subproductos luminiscentes que se pueden medir con un luminómetro. Dado que la emisión de un fotón resulta de una reacción química y no de la excitación de la luz, no hay interferencia de fondo.
Tabla 2. Sustratos HRP de colorimétricos, fluorimétricos y quimioluminiscentes
Sustrato | Detección | Absorbancia (nm) | Exitación (nm) | Emisión (nm) | Unit | Cat. |
| TBM | Colorimetric | 450 nm / yellow 650 nm / blue | – | – | 100ml / 1 L | 11012 11003 |
| Luminol | Chemiluminescent | – | – | 410 nm | 1 mg | 11050 |
| Amplite® Red | Fluorimetric | – | 570 nm | 583 nm | 1000 ensayos | 11011 |
| Amplite® IR | Fluorimetric | – | 646 nm | 667 nm | 1 mg | 11009 |
| Amplite® Blue | Fluorimetric | – | 324 nm | 409 nm | 25 mg | 11005 |
| Amplite® ADHP | Fluorimetric | – | 570 nm | 583 nm | 25 mg | 11000 |
| ABTS | Colorimetric | 420 nm | – | – | 100 ml / 1 L | 11013 11001 |
Los kits de etiquetado de anticuerpos de peroxidasa (HRP) Buccutite™ permiten a los investigadores etiquetar anticuerpos de manera eficiente con HRP en menos de 2 horas. Todo el proceso de marcaje se completa en dos sencillos pasos de mezclado sin purificación posterior en columna. Los conjugados Buccutite™ HRP son ideales para diversas aplicaciones de inmunoensayos, incluidos ELISA, IHC y transferencia Western, y son muy estables para el almacenamiento a largo plazo. Los kits de marcaje de anticuerpos contra peroxidasa Buccutite™ están disponibles en tres tamaños optimizados para marcar 25 µg, 100 µg y 1 mg de anticuerpo por reacción de marcaje.
Para aplicaciones difíciles que requieren un nivel adicional de sensibilidad, ofrecemos kits de etiquetado de anticuerpos Buccutite™ Poly-HRP. Estos kits permiten el marcaje directo de anticuerpos contra polímeros de HRP, lo que da como resultado conjugados que brindan la mayor sensibilidad y relación señal-ruido. Los conjugados de poli-HRP son ideales para aplicaciones donde el objetivo de interés es poco abundante o cuando el volumen de la muestra es limitado.
Tabla 3. Kits Buccutite HRP & Poly-HRP Antibody Labeling kits diseñados para etiquetar anticuerpos con HRP y Poly-HRP.
| Producto | Etiquetato / Reaccion | Unidad | No. Cat. |
| Buccutite™ Peroxidase (HRP) Antibody Conjugation Kit | Optomized for Labeling 25ug protein | 2 Labelings | 5505 |
| Buccutite™ Peroxidase (HRP) Antibody Conjugation Kit | Optimized for Labeling 100ug protein | 2 Labelings | 5503 |
| Buccutite™ Peroxidase (HRP) Antibody Conjugation Kit | Optimized for Labeling 1mg protein | 1 Labeling | 5504 |
| Buccutite™ Peroxidase (HRP) Antibody Conjugation Kit | Optimized for Labeling 1mg protein | 5 Labeling | 5506 |
| Buccutite™ Poly-HRP Antibody Conjugation Kit | Optimized for Labeling 50ug protein | 1 Labeling | 5518 |
| Buccutite™ Poly-HRP Antibody Conjugation Kit | Optimized for Labeling 50ug protein | 2 Labeling | 5519 |
La amplificación de señal Power Styramide™ (PSA™) es una tecnología basada en el depósito informador catalizado (CARD) altamente sensible que se emplea comúnmente en la detección de objetivos de baja abundancia que se encuentran en las aplicaciones IHC, ICC e ISH. La tecnología se basa en la deposición in situ de estiramida catalizada por HRP sobre y directamente adyacente a una molécula diana de interés (proteína, carbohidrato o ácido nucleico). En presencia de bajas concentraciones de peróxido de hidrógeno, la HRP convierte un sustrato de estiramida marcado en una especie altamente reactiva que se une covalentemente a los residuos de tirosina accesibles en las proteínas cercanas a la HRP. Esto produce un marcado de estiramida de alta concentración, lo que da como resultado una sensibilidad excepcionalmente alta de este sistema para objetivos de baja abundancia.
Hay disponibles sondas Power Styramide que han sido etiquetadas con colorantes iFluor™ Styramide, alternativas superiores a los colorantes de tiramida Alexa Fluor®. También están disponibles conjugados con una variedad de haptenos, que incluyen biotina, DNP, cloranfenicol, sulfatiazol, cinoxacina, fentanilo, danofloxacina, AOZ y DIG. Para aplicaciones de detección multicolor, se pueden realizar varias rondas de amplificación de señal de estiramida utilizando diferentes kits de amplificación de estiramida. Al seguir el paso de deposición de PSA™ con eliminación de anticuerpos en IHC fluorescente multiplex, PSA™ facilita la detección de objetivos de baja abundancia y, además, simplifica la selección del panel de anticuerpos, ya que se pueden usar anticuerpos primarios, independientemente de la especie o el isotipo del huésped.
Inmunotinción secuencial de adenocarcinoma de pulmón humano incluido en parafina y fijado con formaldehído utilizando los kits de imágenes iFluor™ PSA™. Las EpCam se marcaron con anticuerpos anti-EpCam de conejo y el iFluor™ 488 PSA™ Imaging Kit con IgG anti-conejo de cabra (Cat No. 45205), seguido de lavado. Pan-keratina se marcó con anticuerpos anti-pan-keratina de ratón y el iFluor™ 555 PSA™ Imaging Kit con cabra anti-ratón IgG (Cat No. 45270). Los núcleos se marcaron con DAPI (Cat No. 17507). Las imágenes fueron adquiridas en un microscopio confocal.
Tabla 4. Kits de imágenes iFluor® PSA™ disponibles
| iFluor® PSA™ Imaging Kit | Secondary Antibody-HRP | Excitation (nm) | Emission (nm) | Filter Set | Unidad | Cat. |
| iFluor® 350 PSA™ Imaging Kit | Goat Anti-Mouse IgG-HRP | 344 | 448 | DAPI | 100 tests | 45250 |
| iFluor® 350 PSA™ Imaging Kit | Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | 344 | 448 | DAPI | 100 tests | 45200 |
| iFluor® 488 PSA™ Imaging Kit | Goat Anti-Mouse IgG-HRP | 491 | 514 | FITC | 100 tests | 45260 |
| iFluor® 488 PSA™ Imaging Kit | Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | 491 | 514 | FITC | 100 tests | 45205 |
| iFluor® 555 PSA™ Imaging Kit | Goat Anti-Mouse IgG-HRP | 552 | 567 | Cy3/TRITC | 100 tests | 45270 |
| iFluor® 555 PSA™ Imaging Kit | Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | 552 | 567 | Cy3/TRITC | 100 tests | 45220 |
| iFluor® 594 PSA™ Imaging Kit | Goat Anti-Mouse IgG-HRP | 592 | 619 | Cy3/TRITC | 100 tests | 45280 |
| iFluor® 594 PSA™ Imaging Kit | Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | 592 | 619 | Cy3/TRITC | 100 tests | 45230 |
| iFluor® 647 PSA™ Imaging Kit | Goat Anti-Mouse IgG-HRP | 649 | 665 | Cy5 | 100 tests | 45240 |
| iFluor® 647 PSA™ Imaging Kit | Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | 649 | 665 | 665 | 100 tests | 45290 |
Tabla 5. Productos HRP
| Catalogo | Producto | Unidad |
| 11021 | Horseradish Peroxidase (Optimized for Conjugation) | 10 mg |
| 11022 | HRP-Biotin Conjugate | 5 mg |
| 11025 | ReadiUse™ Preactivated HRP NHS ester | 300 ug |
| 11026 | ReadiUse™Preactivated HRP maleimide | 300 ug |
| 45900 | ReadiUse™Stayright™ Purple *HRP Chromogen Premixed with Hydrogen Peroxide* | 5 ml |
| 45905 | Stayright™ Purple HRP Staining Kit | 5 ml |
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